microRNA-326的抑制劑在制備治療白內(nèi)障的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及microRNA-326的抑制劑在制備 治療白內(nèi)障的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 凡是各種原因如老化、遺傳、局部營養(yǎng)障礙、免疫與代謝異常、外傷、中毒、輻射等， 都能引起晶狀體代謝紊亂，導(dǎo)致晶狀體蛋白質(zhì)變性而發(fā)生混濁，稱為白內(nèi)障，此時光線被混 濁晶狀體阻擾無法投射在視網(wǎng)膜上，導(dǎo)致視物模糊。多見于40歲以上，且隨年齡增長而發(fā) 病率增多。
[0003] microRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后 組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，通過堿基互補 配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻譯。研宄表明miRNAs參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、 器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。
[0004] microRNA-326在調(diào)控多種腫瘤的發(fā)病中起重要作用，有文獻(xiàn)報道，microRNA-326 的表達(dá)與食管癌的預(yù)后相關(guān)；在結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中也發(fā)揮重要作用，在多發(fā)性 硬化病人中表達(dá)上調(diào)且通過作用于CD47發(fā)揮作用，在肺纖維化病人中調(diào)控TGF-0因子的 促纖維化作用，也有報道m(xù)icroRNA-326能作為臨床藥物治療的候選檢測靶點。
[0005] betaB2晶狀體蛋白（CRYBB2)與白內(nèi)障的產(chǎn)生關(guān)系密切，有研宄表明，在白 內(nèi)障病人晶狀體中其表達(dá)下降（HuangCH,WangYT,TsaiCF,ChenYJ,LeeJS,Chiou SH.Phosphoproteomicscharacterizationofnovelphosphorylatedsitesoflens proteinsfromnormalandcataractoushumaneyelenses.MolecularVision2011 ； 17:186-198.)，CRYBB2基因突變常發(fā)生在外顯子6上，造成氨基酸折疊異常，從而造成晶狀 體結(jié)構(gòu)異常，減弱了在其水溶狀態(tài)下的穩(wěn)定性，引起晶狀體透明性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致先天 性白內(nèi)障的發(fā)生（ChenW，ChenX，HuZ，LinH，ZhouF，LuoL，ZhangX，ZhongX，YangY，Wu CjLinZjYeSjLiuY.AMissenseMutationinCRYBB2LeadstoProgressiveCongenital MembranousCataractbyImpactingtheSolubilityandFunctionofbB2-Crystallin. PLoS0ne.2013;8(ll):e81290.)。本課題組構(gòu)建了CRYBB2基因敲除小鼠模型（張軍， 黃才國，李聞捷，WeiWeng，汪佳祺.0B2晶體蛋白基因敲除小鼠模型的建立.第二軍 醫(yī)大學(xué)學(xué)報.2006 ;27 (11) : 1246-1248.)，并一直進(jìn)行CRYBB2的相關(guān)研究，且在研究中發(fā) 現(xiàn)CRYBB2基因敲除小鼠在出生后數(shù)月內(nèi)發(fā)生皮質(zhì)性白內(nèi)障，其程度隨年齡增長而加重 (ZhangJ,LiJ,HuangC，XueL，PengY，F(xiàn)uQ，GaoL，ZhangJ，LiW.TargetedKnockout oftheMouse0B2_crystallinGene(BetaB2)InducesAge-RelatedCataract.Invest OphthalmolVisSci，2008 ;49 (12):5476-5483.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供microRNA-326的抑制劑的用途。
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種用于治療白內(nèi)障或晶狀體渾濁的DNA序列。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種用于治療白內(nèi)障或晶狀體渾濁的基因載體。
[0009] 本發(fā)明的第四個目的是，提供用于檢測microRNA-326含量的試劑的用途。
[0010] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0011] 第一方面，microRNA-326的抑制劑在制備治療白內(nèi)障的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 第二方面，microRNA-326的抑制劑在制備治療晶狀體渾濁的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 第三方面，microRNA-326的抑制劑在制備藥物中的應(yīng)用，所述的藥物用于治療 betaB2晶狀體蛋白下調(diào)引起的疾病。
[0014] 所述的microRNA-326的抑制劑選自可以降低microRNA-326含量的小干擾RNA、 dsRNA、shRNA、微小RNA、反義核酸；或能表達(dá)或形成所述小干擾RNA、dsRNA、微小RNA、反義 核酸的構(gòu)建物。
[0015] 優(yōu)選地，所述的microRNA-326 的抑制劑為SEQIDNO. 10 第 6-25bp或SEQID NO. 11第6-25bp所示的DNA序列。
[0016] 優(yōu)選地，所述的microRNA-326的抑制劑為包含SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQID NO. 11第6-25bp所示DNA序列的基因載體。
[0017] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0018] 一種用于治療白內(nèi)障或晶狀體渾濁的DNA序列，所述的DNA序列如SEQIDNO. 10 第 6-25bp或SEQIDNO. 11 第 6-25bp所示。
[0019] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0020] 一種基因載體，所述的基因載體含有如SEQIDNO. 10第6-25bp或SEQIDNO. 11 第6-25bp所示的DNA序列。
[0021] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0022] 用于檢測microRNA-326含量的試劑在制備診斷白內(nèi)障或晶狀體渾濁的試劑中的 應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0024] 1、本發(fā)明通過實驗證實microRNA-326可以抑制FGFl的表達(dá)，從而下調(diào)betaB2 的表達(dá)，而betaB2晶體蛋白含量的變化是白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)鍵性因素，betaB2晶體蛋白表 達(dá)量的下調(diào)將導(dǎo)致白內(nèi)障。本發(fā)明提示可通過抑制microRNA-326來治療白內(nèi)障，同時 microRNA-326可作為白內(nèi)障診斷的標(biāo)志物；
[0025] 2、本發(fā)明提供了一種microRNA-326的抑制劑，其抑制作用十分顯著，可用于白內(nèi) 障或晶體渾濁的治療。
【附圖說明】
[0026] 圖1.雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO圖譜。
[0027] 圖2?表達(dá)載體pLKO. 1圖譜。
[0028] 圖3.綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-Nl圖譜。pEGFP-Nl載體的限制性酶切圖和多 克隆位點（MCS)。（單一的限制性位點被加粗）。NotI位點位于EGFP終止子之后。XbaI位點（*)的DNA被CL0NTECH公司甲基化。如果你想要用酶消化該載體，你需要將該載體轉(zhuǎn) 化入dam-型大腸桿菌制備新的DNA。
[0029] 圖4.1^1?隱芯片篩選圖，圖片顯示11111?-326、11111?-204、11111?-330-5口在新生鼠中特異 性低表達(dá)，而在成年鼠中高表達(dá)，且與小鼠視覺系統(tǒng)相關(guān)。
[0030] 圖5.betaB2基因敲除小鼠血清中miRNA篩查，結(jié)果顯示CRYBB2基因敲除后 miR-326和miR-204的表達(dá)均下降，miR-326表達(dá)差異最明顯。
[0031] 圖6.轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定，ABC三條片段均擴(kuò)增出來的為雜合子，僅擴(kuò)增出B條 帶的為野生型，僅擴(kuò)增出A、C兩條片段的為純合子。
[0032] 圖7.在白內(nèi)障患者的血清中檢出較高含量的miR-326。
[0033] 圖8.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-326的靶基因為FGFl。
[0034] 圖9.HLEC-B3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-326模擬物，經(jīng)RT-PCR和westernblot實驗驗證顯 示miR-326可顯著抑制FGFl的表達(dá)。
[0035] 圖 10.Anti-miR-326 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HLEC-B3 細(xì)胞，采用RT-PCR和westernblot進(jìn)行 驗證，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-326抑制載體后FGFl與CRYBB2的表達(dá)顯著上調(diào)。
【具體實施方式】
[0036] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0037] 實施例1
[0038] 1材料和方法
[0039] I. 1 材料
[0040] I.I. 1研宄對象
[0041] 人晶狀體上皮細(xì)胞HLEC-B3細(xì)胞系購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。
[0042] 小鼠C57BL/C，灰色，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。
[0043] 1.1. 2所用載體
[0044] 雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO購自Promega公司，商品號Cat. #E1330,載體圖 譜如圖1所示；表達(dá)載體pLKO. 1購自Addgene公司，載體圖譜如圖2所示；綠色熒光蛋白表 達(dá)載體pEGFP-Nl購自Addgene公司，載體圖譜如圖3所示，在本研宄中作為對照質(zhì)粒。
[0045] 1.1.3PCR引物序列
[0046]
[0047] I. 1. 4目的片段序列
[0048] l)miR-326模擬物的序列
[0049] CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG(SEQIDNO. 5)
[0050] 2)pmirGLO-FGFl野生載體中的FGFl片段
[0051] A-H-FGFl-miR326-WT-F：
[0052] AAACTAGCGGCCGCAAAGATACCCAGAGAGGAAATT(SEQI