一種人3d結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片的制備方法及其臨床應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用人自體表皮干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和基底層角質(zhì)細(xì)胞為種子細(xì)胞，培養(yǎng)具有3D復(fù)層結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片的技術(shù)及其在臨床中的應(yīng)用。表皮干細(xì)胞是一類異質(zhì)性細(xì)胞，具有不同的亞類，其分子特征、分化能力及細(xì)胞巢(resident sites)都不相同。表皮干細(xì)胞主要包括:毛囊干細(xì)胞(HFSCs)、毛囊外根鞘干細(xì)胞、表達(dá)keratin-15的毛囊多潛能干細(xì)胞(follicle pluripotent stem cells，fPSCs)、皮脂腺干細(xì)胞(SGSCs)、汗腺干細(xì)胞(sweat stem cell)和黑色素干細(xì)胞(melancyte stem cell, EP1-NCSCs)和濾泡表皮干細(xì)胞(IFESCs)等。
[0002]主要技術(shù)包括WBB細(xì)胞培養(yǎng)基的應(yīng)用，Wbbase混合酶分離表皮干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞的單層擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片培養(yǎng)技術(shù)以及臨床治療技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0003]皮膚由表皮、真皮和皮下組織組成，是人體最大最復(fù)雜的器官，具有保護(hù)、分泌、感知和代謝功能。皮膚缺損、色素脫失和燒傷等是臨床上的常見疾病，其最主要的治療方法是自體皮膚移植或采用臨時皮膚替代物覆蓋。此外，白癜風(fēng)也是一種常見性皮膚色素脫失性疾病，發(fā)病機(jī)制目前還不清楚，治療方法有激光照射等物理治療法、藥物治療法和自體表皮移植法等方法。表皮移植法需要自體皮膚，然而，由于人體皮膚有限，人們一直在尋找一種永久性皮膚替代物，但永久性皮膚替代物仍依賴于有活性的自體多種皮膚種子細(xì)胞，主要包括各種表皮干細(xì)胞等。
表皮干細(xì)胞具有終身、無限的自我更新能力。它是一種具有產(chǎn)生至少一種以上高度分化子代細(xì)胞潛能的細(xì)胞。從發(fā)生機(jī)制來看，干細(xì)胞并不直接分化產(chǎn)生終末分化細(xì)胞，而是先分化成短暫擴(kuò)充細(xì)胞，短暫擴(kuò)充細(xì)胞有產(chǎn)生定向分化成某種終末分化細(xì)胞的能力，因而是定向祖細(xì)胞。短暫擴(kuò)充細(xì)胞再經(jīng)過幾次到十幾次不等的分裂后定向分化，進(jìn)一步可分化為有絲分裂后細(xì)胞及終末分化細(xì)胞。短暫擴(kuò)充細(xì)胞的存在說明組織靠較少量的干細(xì)胞分裂為很多的子代分化細(xì)胞。干細(xì)胞自我更新和分化的方式通常有兩種，一種是不對稱方式分裂，即I個干細(xì)胞分裂成I個干細(xì)胞和一個定向祖細(xì)胞，常見于單細(xì)胞生物和無脊椎動物；另一種是具有高度調(diào)控機(jī)制的分裂方式，干細(xì)胞按一定的概率分裂成干細(xì)胞或定向祖細(xì)胞，BP干細(xì)胞按一定的概率分裂為兩個干細(xì)胞或兩個定向祖細(xì)胞，或按不對稱方式分裂。一般認(rèn)為哺乳類動物即以此種方式進(jìn)行自我組織更新。細(xì)胞的更新具有準(zhǔn)確無誤性，干細(xì)胞在整個增殖過程中處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，而由短暫擴(kuò)充細(xì)胞完成DNA合成和細(xì)胞擴(kuò)充的任務(wù)，干細(xì)胞在分裂后仍保留其原有的遺傳信息，短暫擴(kuò)充細(xì)胞擁有新復(fù)制DNA序列，以保證差錯僅停留在短暫擴(kuò)充細(xì)胞水平。通常干細(xì)胞等數(shù)分裂干細(xì)胞和定向祖細(xì)胞，當(dāng)受到損傷等情況時，干細(xì)胞的分裂方式會發(fā)生改變以適應(yīng)機(jī)體的需要。
[0004]皮膚上皮層是一層保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)境損傷的重要屏障。該層主要為角質(zhì)細(xì)胞類型，包含了大約85%的活表皮細(xì)胞。角質(zhì)層是復(fù)扁平上皮細(xì)胞。在表皮基底層，角質(zhì)細(xì)胞分化、增殖，隨著角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生角蛋白并上移至表皮表面后，發(fā)生程序性死亡。角蛋白細(xì)胞增殖、分化及凋亡是復(fù)雜且嚴(yán)格控制的過程。角蛋白細(xì)胞可產(chǎn)生很多細(xì)胞因子和生長因子，包括 IL-1, IL-3, IL-6, IL-8,集落刺激因子，TNF-alpha, TGF-alpha and beta,成纖維細(xì)胞生長因子，雙調(diào)蛋白和PDGF。除了保護(hù)功能之外，角蛋白細(xì)胞在組織穩(wěn)態(tài)、傷口恢復(fù)、癌癥以及皮膚基因治療上有著重要的作用。人角蛋白細(xì)胞能表達(dá)粘附分子和細(xì)胞因子，能參與皮膚免疫和動態(tài)平衡。
[0005]黑色素細(xì)胞起源于外胚層的神經(jīng)嵴，位于表皮的基底層，與表皮細(xì)胞共同組成表皮黑色素單位，其主要功能是產(chǎn)生黑色素小體保護(hù)皮膚免受損害。I960年Cruickshank首次報道體外培養(yǎng)黑色素細(xì)胞以來，由于培養(yǎng)技術(shù)未突破，一直未得到大量純化的黑色素細(xì)胞。1982年，美國Eisinger和Marco用一種含有致癌因子TPA的培養(yǎng)基培養(yǎng)出大量人黑色素細(xì)胞，但僅能存活幾個月。
[0006]近年來，對表皮細(xì)胞、表皮干細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等單獨(dú)培養(yǎng)方法的報導(dǎo)很多，但目前還未見到將三種細(xì)胞共培養(yǎng)形成具有三維復(fù)層結(jié)構(gòu)表皮的報道。因此，建立一種表皮干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞形成三維復(fù)層結(jié)構(gòu)表皮的制備方法與移植新技術(shù)具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種人表皮干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和基底層角質(zhì)細(xì)胞形成3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片的制備方法及其在皮膚缺失、燒傷和皮膚色素脫失性疾病中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的:一種人表皮干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和基底層角質(zhì)細(xì)胞形成3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
1)用Wbbase混合酶一次性分離人皮膚干細(xì)胞、基底角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞等；
2)3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片的兩步培養(yǎng)法，第一步，三種細(xì)胞無血清混合單層擴(kuò)增培養(yǎng)，第二步，細(xì)胞的誘導(dǎo)分化共培養(yǎng)，形成3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片；
3)3D結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜片的剝離方法，該方法不需用酶消化黏附在培養(yǎng)皿上的表皮，可完整保護(hù)細(xì)胞的活性；
4)3D結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜片的臨床移植方法，用皮膚打磨機(jī)將白癜風(fēng)皮損處磨至點(diǎn)狀滲血，將復(fù)層結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片貼在打磨處，用敷料包扎。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢在于:
(I)Wbbase混合酶同時分離三種不同細(xì)胞方法，其分離有效時間窗口為5_10小時，比傳統(tǒng)的胰酶分離有效時間窗口 2分鐘提高了 150-300倍，且分離后不需中和酶的活性，分離細(xì)胞表面的膜受體和膜蛋白保存完整，細(xì)胞活性大于95%，細(xì)胞總收率大于1-5 XlOVg皮膚。
[0010](2)3D結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜片的兩步共培養(yǎng)方法；WBB培養(yǎng)基可同時擴(kuò)增三種細(xì)胞，擴(kuò)增倍數(shù)在100-120倍之間，是傳統(tǒng)方法的5倍。
[0011](3)該技術(shù)制備的3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片中黑色素細(xì)胞和表皮細(xì)胞的比例接近正常人表皮結(jié)構(gòu)。
[0012](4)該3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片可用于白癜風(fēng)、燒傷后色素減退等皮膚色素脫失性皮膚病及各種創(chuàng)傷的治療，移植后皮膚復(fù)色效果接近或與本人膚色一致。
【附圖說明】
[0013]圖1和圖2是培養(yǎng)的3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片照片；
圖3是白癒風(fēng)患者治療如照片；
圖4是白癜風(fēng)患者移植3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片后一個月照片。
【具體實施方式】
[0014]實施例1
1、人表皮干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的共分離
在無菌條件下將無菌2X 2cm2正常全層皮置于盛有20ml WBB無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用WBB細(xì)胞分離器將皮膚制備成直徑為0.1mmX0.1mm2組織顆粒，將組織顆粒置于含有Wbbase混合酶的WBB培養(yǎng)基中酶解，4°C酶解10-12小時，過濾，離心分離，得到多種高活性種子細(xì)胞，包括基底層角質(zhì)細(xì)胞、黑色素干細(xì)胞、短暫擴(kuò)充細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、濾泡間表皮干細(xì)胞(Interfollicle Epidermal Stem Cell，IFESCs)皮脂腺干細(xì)胞等。基底層角質(zhì)細(xì)胞、黑色素干細(xì)胞、短暫擴(kuò)充細(xì)胞三種細(xì)胞活性分別達(dá)到95%以上，細(xì)胞總收率大于1-5X107/克皮膚。
[0015]2、三種細(xì)胞無血清混合單層擴(kuò)增培養(yǎng)
將三種種子細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿上，細(xì)胞密度為1-2 X 16個細(xì)胞/直徑60mm培養(yǎng)皿，加5mlWBB單層細(xì)胞培養(yǎng)基，370C，5%C02培養(yǎng)，每48小時更換一次培養(yǎng)基，4_7天細(xì)胞達(dá)到80-90%的匯合。
[0016]3、3D結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞膜片的共培養(yǎng)
當(dāng)單層培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80-90%的匯合后，吸出培養(yǎng)皿中的單層細(xì)胞培養(yǎng)基，另加入5mlffBB無血清細(xì)胞分化培養(yǎng)基，370C，5%C02培養(yǎng)，每48小時更換一次培養(yǎng)基，經(jīng)7_10天