4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 氧化應激（Oxidative Stress)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導 致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應激是破壞了強氧 化劑和抗氧化劑的平衡導致的潛在傷害，氧化劑、抗氧化劑平衡的破壞是細胞損傷的主要 原因。氧化應激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用，并被認為是導致衰老和疾病的一 個重要因素。另外，腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI) 是缺血性腦血管?。↖schemic cerebrovascular diseases，ICVD)的主要病理過程，而氧化 應激（oxidative stress，OS)是造成CIRI的重要因素，因此，抗氧化應激損傷對ICVD的治 療及預后也具有重要意義。
[0003] 4-甲氧基芐醇，無色或微黃色液體。熔點23-25.5°C，沸點159°C，相對密度 1. 113 (15/15°C )，折光率1. 5442。易溶于醇和醚，幾乎不溶于水，其化學式為：C8H1(l02,結構 式為、。。目前4-甲氧基芐醇通常作為食用香料食用，未見其用于抗氧化的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑中的用途。
[0005] 抗氧化劑（AOA)也叫清除劑，是一類能夠抑制或阻斷自由基鏈式反應的啟動和增 生（蔓延）過程，降低自由基濃度，延緩哀老進程，提高生命活力的化合物。
[0006] 本發(fā)明首先提供了 4-甲氧基芐醇在制備抗氧化劑類藥物中的用途。
[0007] 進一步地，所述抗氧化劑類藥物是抗氧化損傷的藥物。
[0008] 更進一步地，所述抗氧化損傷的藥物是預防和/或治療氧化應激損傷的藥物。
[0009] 再進一步地，所述藥物是降低ROS水平、提高SOD活力、提高GSH含量和/或抗細 胞凋亡的藥物。
[0010] ROS :活性氧；SOD :超氧化物歧化酶活力；GSH :谷胱甘肽。
[0011] 其中，所述制劑為口服制劑。
[0012] 其中，所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種抗氧化損傷的藥物，它是以4-甲氧基芐醇為活性成分，加上 藥學上可接受的輔料制備而成的制劑。
[0014] 所述制劑為口服制劑。
[0015] 4-甲氧基芐醇可通過降低細胞內(nèi)ROS水平、提高SOD活力、提高GSH含量和/或抗 細胞凋亡發(fā)揮抗氧化損傷的作用，從而提高細胞存活率，可以制備成為抗氧化劑，用于預防 抗氧化損傷，應用前景良好。
[0016] 下面通過【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步詳細說明，但是并不是對本發(fā)明的限 制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
【附圖說明】
[0017] 圖1 4-甲氧基芐醇對H2O2損傷PC12細胞后MMP變化（40 X 10)。
[0018] 圖2 4-甲氧基節(jié)醇對!1202致PC12細胞氧化損傷后。Caspase-9、Caspase-12、 Caspase-3 表達的影響（注：lControl、2Model、3Eda-160、4MA-20、5MA-40、6MA-80) 〇
[0019] 圖3 4-甲氧基芐醇對H2O2致PC12細胞氧化損傷后ERK1/2、P-ERK1/2、JNK、P-JNK、 p38、P-p38 蛋白表達的影響。（注：lControl、2Model、3Eda-160、4MA-20、5MA-40、6MA-80、 7Model+抑制劑、8Eda-160+抑制劑、9MA-20+抑制劑、10MA-40+抑制劑、11MA-80+抑制劑）。
【具體實施方式】
[0020] 實驗例1 4-甲氧基芐醇的抗氧化作用
[0021] 第一部分、抗氧化損傷的作用
[0022] 1實驗材料
[0023] I. 1實驗細胞
[0024] 高分化大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株（PC12細胞），購自中國科學院上海生命科 學研宄院。
[0025] 1.2實驗藥品
[0027] 1. 3實驗試劑
[0028]
[0032] I. 5· 1完全培養(yǎng)基
[0033] FBS與改良型RPMI-1640培養(yǎng)基以1:9的比例，配制為含10% FBS的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，同時加入l〇〇U/mL青霉素-鏈霉素溶液，密封4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] I. 5. 2PBS 緩沖液
[0035] 取9. 88g PBS液混合干粉溶解于IL雙蒸水，完全溶解后調(diào)PH至7. 4,過濾除菌， 4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] I. 5· 3MTT 溶液
[0037] MTT干粉0. 25g，加50mL PBS緩沖液，完全溶解后過濾除菌，2mL分裝，-20°C保存 備用，全程避光操作。
[0038] 1. 5· 4H202造模液
[0039] 取30% H2O2原液ImL加入9mL無菌雙蒸水，輕輕混勾，取混勾后的H2O 2液0· ImL加 入9. 9mL無菌雙蒸水，輕輕混勾，再取第二次混勾后H2O2液ImL加入9mL無菌雙蒸水，輕輕 混勻即得H 2O2造模液的高濃度儲備液（lmmol/L)，配制過程和配制后的各濃度H2O 2溶液皆 注意嚴格避光和無菌操作，并貼好標簽4°C避光保存，臨用前取H2O2造模液的高濃度儲備液 按1 : 19的比例加入到37°C溫熱過的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中輕輕混勻多次，即得濃度 為50 μ mol/L的H2O2造模液，H 202造模液現(xiàn)配現(xiàn)用，需多少配多少。
[0040] 1. 6藥物配制
[0041] 1. 6. 1 4-甲氧基芐醇
[0042] 精密稱取適量4-甲氧基芐醇加入DMSO配制成8. 0 X IO4 μ g/mL的高濃度儲備液， 每管30 μ L定量分裝，-20°C避光保存，實驗前取一管用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋配制 成所需給藥濃度組的最高濃度，過濾除菌，用此濃度依次稀釋成所需的其余給藥組濃度，務 必保證每個組的DMSO終濃度一致，并且終濃度小于0. 2 %。
[0043] 1. 6. 2 依達拉奉（Edaravone Injection)
[0044] 依達拉奉是一種腦保護劑（自由基清除劑），抑制脂質過氧化，從而抑制腦細胞、 血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞的氧化損傷.
[0045] 精密稱取依達拉奉32mg加入到20mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，在55°C的水浴 中輕輕攪拌至全部溶解，于無菌生物安全柜中過濾除菌，即得濃度為I. 6mg/mL的依達拉奉 儲備液，4°C避光保存，臨用前按所需濃度換算稀釋比例，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基進行 稀釋給藥。
[0046] 2實驗方法
[0047] 2. 1PC12細胞的復蘇、傳代培養(yǎng)與凍存
[0048] 2. I. 1PC12細胞的復蘇
[0049] 從-80 °C冰箱中取出一支PCl2細胞凍存管立即放入37 °C水中快速振搖，直至完全 融化，噴淋75 %酒精消毒外壁，于生物安全柜中將細胞懸液移入裝有5mL完全RPMI-1640培 養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于37°C、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的0)2培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)，4h后換液，過夜后再換液。
[0050] 2. I. 2PC12細胞的傳代培養(yǎng)
[0051] 待復蘇培養(yǎng)的PC12細胞長至70 %-80 %的貼壁率時，棄原培養(yǎng)基，取2mL PBS液清 洗一次，加入0. 25%胰酶2mL置于培養(yǎng)箱中消化3min，搖動培養(yǎng)瓶使細胞脫離瓶壁，顯微鏡 下觀察當細胞收縮變圓，脫離瓶壁后，加入2mL完全RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，以1000 r/ min離心5min，棄上層液體，加入2mL完全RPMI-1640培養(yǎng)基，均勻吹打分散細胞制成細胞 懸液，分瓶傳代，傳代培養(yǎng)過程中，約2d更換一次新鮮培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細胞用于實 驗。
[0052] 2. I. 3PC12細胞的凍存
[0053] 當PC12細胞生長至對數(shù)生長期時，按2. 1. 2所述方法制成細胞濃度為IO6級的細 胞懸液，在每個I. 5mL的凍存管中加入0. 9mL懸液和0.1 mL 100 %的DMS0,吹打均勻，將密 封好的凍存管放入程序降溫盒中直接放入-80 °C冰箱，過夜后移入-80°C冰箱里普通凍存 盒內(nèi)保存。
[0054] 2. 2 4-甲氧基芐醇對氧化損傷PC12細胞存活率的影響
[0055] 2. 2. 1 方法
[0056] 當PC12細胞生長至對數(shù)生長期時，按2. 1. 2所述方法制成細胞濃度為3 X IO4個/ mL的細胞懸液，接種于96孔板上，置于37 °C、5 % CO2、95 %空氣、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)24h后，分為正常對照組、H2O2損傷、依達拉奉組（160 μ g/m