黃酮類化合物黃芩素在抑制皮膚瘢痕形成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及黃酮類化合物黃芩素的一種新的醫(yī)藥用途，具體地說，涉及黃酮類化合物黃芩素在抑制皮膚瘢痕形成中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]瘢痕形成是創(chuàng)傷愈合后最常見的并發(fā)癥之一。瘢痕形成后影響患者的容貌，并伴有癢痛，而且產(chǎn)生的攣縮可導(dǎo)致不同程度的功能障礙，如肌腱攣縮、關(guān)節(jié)脫位、運(yùn)動(dòng)功能障礙、職業(yè)心理障礙等，降低了患者的生活質(zhì)量，為后期治療帶來沉重經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國人燒傷后增生性瘢痕的發(fā)生率為91.4%，燒傷創(chuàng)面愈合時(shí)間若超過2周，增生性瘢痕發(fā)生率高達(dá)74.67%，遠(yuǎn)高于國外報(bào)道的38.00%。瘢痕的防治研宄是一個(gè)既古老又新穎的課題。研宄發(fā)現(xiàn)瘢痕增生是人體對(duì)創(chuàng)傷的一種過度的愈合反應(yīng)，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞異常增殖、異?；罨?、異常收縮及膠原過度沉積為組織學(xué)特點(diǎn)的皮膚纖維增生性疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此目前其治療仍是臨床上頗為棘手的難題。多年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)瘢痕的發(fā)生、發(fā)展及消退的機(jī)理進(jìn)行了多角度、多層面的深入研宄，但直至目前對(duì)其機(jī)制的研宄尚無明確的結(jié)論，防治方面也尚無良方，較一致的看法有:(I)瘢痕增生主要的效應(yīng)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞；(2)瘢痕病理性成纖維細(xì)胞過度增殖活化是其主要的生物學(xué)層面表現(xiàn)；(3)TGF-f3 1/Smad信號(hào)通路與成纖維細(xì)胞的增殖、分化、迀徙、凋亡及膠原代謝等多種生理、病理過程密切相關(guān)，Smads根據(jù)不同分型對(duì)成纖維細(xì)胞膠原代謝具有雙向調(diào)控作用。
[0003]目前在臨床治療中，治療疤痕方法有壓力治療、皮質(zhì)類固醇激素聯(lián)合5-FU注射治療、硅膠膜和水凝膠敷料治療、激光治療、射線治療、冷凍治療等。然而，能夠抗疤痕的小分子藥物仍然非常有限。目前的抗疤痕藥物多是抗炎藥(如:類固醇激素)或者細(xì)胞毒藥物(如:5-FU)，且其抗疤痕的效果微弱且不穩(wěn)定，并且有廣泛的毒副作用。因此尋找一種分子量小的脂溶性的分子，可以直接穿透表皮屏障而作用于瘢痕成纖維細(xì)胞，從而抑制其增殖與活化是很有前景的治療手段。
[0004]黃芩素是一種黃酮類化合物，英文名Baicalein，化學(xué)式C15HltlO5,分子量270.24，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。其于冰醋酸，堿性水溶液呈黃色，幾乎不溶于水、乙醇溶液，味很苦。黃芩素可作為藥品，具有降低腦血管阻力，改善腦血循環(huán)、增加腦血流量及抗血小板凝集的作用。
[0005]中國專利文獻(xiàn)201410315053.2，公開日2014年11月5日公開了黃酮類化合物槲皮素在抑制皮膚瘢痕形成和皮膚纖維化中的應(yīng)用。中國專利文獻(xiàn)200910200927.9，公開日2011年6月29日公開了黃芩素的醫(yī)藥新用途，在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病藥物中的應(yīng)用。中國專利文獻(xiàn)201310049129.7，公開日2013年5月22日公開了漢黃芩素的醫(yī)藥用途，用于治療高膽固醇血癥。但是關(guān)于黃芩素在抑制皮膚瘢痕形成方面的作用，目前還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供黃芩素的新用途。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
[0008]第一方面，提供黃芩素的用途，用于制備抑制皮膚瘢痕形成的試劑。
[0009]所述的黃芩素通過與TGF TGF β RI (ALK5)結(jié)合來抑制細(xì)胞內(nèi)TGF β I信號(hào)通路，從而抑制皮膚瘢痕的形成。所述的試劑為藥品或化妝品。
[0010]第二方面，提供黃芩素的用途，用于制備試劑，所述的試劑用于:
[0011]a)抑制皮膚成纖維細(xì)胞的增殖；或
[0012]b)抑制皮膚成纖維細(xì)胞a -SMA表達(dá)；或
[0013]c)抑制皮膚成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化；或
[0014]d)抑制皮膚成纖維細(xì)胞Smad2/3信號(hào)蛋白磷酸化；或
[0015]e)抑制皮膚成纖維細(xì)胞Smad2/3信號(hào)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。
[0016]所述的皮膚成纖維細(xì)胞為皮膚瘢痕來源的成纖維細(xì)胞。
[0017]第三方面，提供黃芩素的用途，用于制備抑制皮膚瘢痕來源的成纖維細(xì)胞收縮和/或迀移的試劑。
[0018]第四方面，提供黃芩素的用途，用于制備抑制皮膚成纖維細(xì)胞ALK5的激酶活性的試劑。
[0019]第五方面，提供黃芩素的用途，用于制備抑制張力誘導(dǎo)的小鼠瘢痕形成的試劑。用于降低小鼠瘢痕體積。
[0020]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
[0021]本發(fā)明證實(shí)黃酮類化合物黃芩素可抑制人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，且能夠抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化從而抑制皮膚瘢痕形成。本發(fā)明進(jìn)一步探宄了黃芩素抑制皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞增殖與活化的生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)黃芩素是通過與TGF0RI(ALK5)結(jié)合來抑制細(xì)胞內(nèi)TGF β 1/Smad信號(hào)通路來有效地抑制人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的病理性增殖活化。動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黃芩素作用于小鼠皮膚后可以抑制張力誘導(dǎo)的小鼠皮膚瘢痕形成。由于黃芩素分子量小且脂溶高，透皮吸收能力好，因此該分子可用于制備抗皮膚瘢痕形成的藥物，在醫(yī)療、整形及化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0022]圖1是黃芩素分子結(jié)構(gòu)式。
[0023]圖2A是兩組小鼠皮膚全層切開后分別給予牽張傷口 +涂抹DMSO、牽張傷口 +涂抹黃芩素14天后小鼠疤痕部位皮膚大體觀、HE染色、Masson三色染色結(jié)果以及疤痕大體觀面積統(tǒng)計(jì)、疤痕切面面積統(tǒng)計(jì)與瘢痕指數(shù)統(tǒng)計(jì)。瘢痕指數(shù)=瘢痕最大厚度/瘢痕周圍正常皮膚厚度。
[0024]圖2B是兩組小鼠皮膚全層切開后分別給予牽張傷口 +涂抹DMS0、牽張傷口 +涂抹黃芩素14天后小鼠疤痕部位皮膚天狼星紅染色(顯示膠原纖維)的普通光鏡下結(jié)果及偏光顯微鏡下結(jié)果及膠原密度統(tǒng)計(jì)。偏光顯微鏡可以特異性將皮膚膠原折射出紅色，而其他組織不顯色。
[0025]圖3A是兩組小鼠皮膚全層切開后分別給予牽張傷口 +涂抹DMS0、牽張傷口 +涂抹黃芩素14及28天后小鼠疤痕部位皮膚增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化染色結(jié)果及PCNA陽性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0026]圖3B是DMSO或10 μ M黃芩素作用于人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞48h及72h后，用EDU標(biāo)記正在增殖(S期，DNA合成期)細(xì)胞的檢測結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析。
[0027]圖4A是兩組小鼠皮膚全層切開后分別給予牽張傷口 +涂抹DMS0、牽張傷口 +涂抹黃芩素14及28天后小鼠疤痕部位皮膚α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)免疫組化染色結(jié)果及a -SMA陽性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0028]圖4Β是兩組細(xì)胞加入TGF β I (2ng/ml)條件下，DMSO或10 μ M黃芩素作用于人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞48h及72h后，a-SMA及肌動(dòng)蛋白(F_actin)免疫熒光染色結(jié)果。
[0029]圖4C 是在加入 TGF β I (2ng/ml)條件下，DMSO 或 I μ M、5 μ M、10 μ M、25 μ M 黃芩素作用于人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞3天后，a -SMA蛋白表達(dá)檢測結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析。
[0030]圖5Α是DMSO或I μ Μ、5 μ Μ、10 μ M黃芩素作用于膠原3D培養(yǎng)的人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞0、24、48及72小時(shí)后，膠原塊收縮情況及收縮率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0031]圖5Β是人皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)后，經(jīng)DMSO或I μΜ、5μΜ、10μΜ黃芩素處理0、24、48及72小時(shí)后，細(xì)胞迀移情況及統(tǒng)計(jì)分析。
[0032]圖6Α是DMSO或I μ Μ、5 μ Μ、10 μ M黃芩素作用12小時(shí)后TGF β I信號(hào)通路(Smad2/P-Smad2/Smad3/P-Smad3/Smad4/Smad6/Smad7)、 BMP-2 信號(hào)通路(SmadI/5/8、P-Smadl/5/8)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果。
[0033]圖6B 是 DMSO 或 I μ Μ、5 μ M、10 μ M 黃芩素作用 12 小時(shí)后 TGF β 1、TGF β RI 及TGFβ RII蛋白表達(dá)檢測結(jié)果。
[0034]圖6C是在加入TGF0 l(2ng/ml)條件下，DMSO及10 μM黃芩素作用2小時(shí)后，Smad2/3入核情況檢測結(jié)果。
[0035]圖6D是計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接，黃芩素與TGF β RI (ALK5)激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0037]實(shí)施例1
[0038]一、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0039]1.黃芩素分子理化性質(zhì)
[0040]實(shí)驗(yàn)所用黃芩素(CAS491-67-8)分子購自 Selleck 公司(cat.n0.S2268)。
[0041]藥物透過角質(zhì)層和表皮進(jìn)入真皮是藥物透過皮