一種用于治療乙型病毒性肝炎的siRNA組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療乙型病毒性肝炎的siRNA組合 物。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型病毒性肝炎（Hepatitis B)，簡稱乙肝，也稱血清型肝炎（Serum Hepatitis)， 是一種由乙型肝炎病毒引起的疾病。乙型肝炎病毒會(huì)引起肝硬化和肝癌。乙肝主要在中國 及其他一些亞洲國家中流行，在非洲薩哈拉沙漠南方也非常盛行。2006年中國人口中乙肝 表面抗原攜帶率為7. 18%。型肝炎與肺結(jié)核和艾滋病并列世界上最常見的傳染病。乙型肝 炎是全球死亡原因的第10位，全世界約有3. 5~4億人感染乙型肝炎病毒，人數(shù)高達(dá)艾滋 病感染者的八倍以上。
[0003] 乙肝病毒嚴(yán)重困擾著人們的生活、工作和身心健康，我國每年約30萬人因乙肝病 毒感染導(dǎo)致肝衰竭、肝硬化、肝癌而死亡。治療HBV的最終目標(biāo)是抑制或消除HBV，緩和或停 止HBV感染引起的肝損傷，防止肝功能衰竭和肝癌的發(fā)展。最重要短期和中期治療目標(biāo)是 最大限度地提高HBV DNA抑制率。但是，徹底根除B型肝炎病毒是困難的，因?yàn)樗系剿?主基因組中，產(chǎn)生繼續(xù)作為潛在復(fù)發(fā)傾向的cccDNA。聚乙二醇干擾素 a -2a、干擾素 a -2a、 核苷類藥物和核苷酸類似物是FDA批準(zhǔn)的抗HBV藥物市場上常用的藥物。干擾素治療的主 要缺點(diǎn)是其顯著的副作用，限制其長期使用。它對失代償期肝硬化與轉(zhuǎn)氨酶正常患者往往 是無效的。此外，只有三分之一的患者對PEG-IFN-α抗病毒有效。雖然核苷（酸）類似物 抑制HBV復(fù)制并能使肝臟壞死性炎癥減少，但不能完全根除病毒。停藥后，多數(shù)患者觀察到 病毒血癥的反彈。此外，長期治療產(chǎn)生耐藥HBV病毒株，導(dǎo)致治療失敗。迫切需要一種全新 的治療方法。
[0004] 專利2013102317308公開了一種用于治療乙型病毒性肝炎的RNA干擾組合物及其 制備方法。該發(fā)明的包裹、保護(hù)效果較差，藥效不能得到充分的發(fā)揮，易被降解，需使用較大 的藥劑量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種用于治療乙型病毒性肝炎的siRNA組合物，所述的組合 物包含siRNA序列和其他組分，所述其他組分為T2C1化合物。
[0006] 所述其他組分為T2C1化合物（公開于ZL201180041450. X大環(huán)脂類化合物及其應(yīng) 用）和陽離子脂質(zhì)。
[0007] 所述其他組分為陽離子脂質(zhì)、T2C1化合物、磷脂、膽固醇和脂質(zhì)-聚乙二醇。
[0008] 所述其他組分按重量份為陽離子脂質(zhì)0. 5-3份，優(yōu)選為1. 5-2. 5份；T2C1化合物 2-8份，優(yōu)選為3-5份；磷脂0. 5-3份，優(yōu)選為0. 7-1份；膽固醇0-2份，優(yōu)選為0-1份；月旨 質(zhì)-聚乙二醇2-10份，優(yōu)選為4-8份；
[0009] 所述其他組分的重量的和與所述siRNA的重量比為（2-40) : 1。所述T2C1化合物 與所述siRNA的重量比為（0. 8-10) :1。
[0010] 所述T2C1化合物的結(jié)構(gòu)式如下：
[0011]
[0012] 所述siRNA序列為ID No. 267 ;所述ID No. 267由一條正義鏈和一條反義鏈組成：
[0013] 正義鏈：CCGUGUGCACUUCGCUUCA[dT] [dT];
[0014] 反義鏈：UGAAGCGAAGUGCACACG⑶C。
[0015] 所述siRNA在5'端和/或3'端的核苷酸單體進(jìn)行硫代修飾。
[0016] 所述siRNA的核糖核酸含有2'修飾；2'修飾為2' -脫氧，2' -脫氧-氟， 2' -0-甲基，2' -0-甲氧基，2' -0-氨基-丙基（2' -0-amino-propyl，2' -0-ΑΡ)，2' -0-二 甲基氨基乙基（2' -〇_dimethylaminoethyl，2' -0-DMA0E)，2' -〇-二甲基氨基丙基 (2 ' -〇-dimethylaminopropy 1，2 ' -0-DMAP)，2 ' 二甲基氨基乙基乙氧基（2 ' -〇-dimethy 1 aminoethyloxyethyl，2' -0-DMAE0E)和 2' -〇_ 二甲基乙酰胺（2' -〇-dimethylacetamide， 2' -0-ΝΜΑ)中的一種或幾種。
[0017] 所述siRNA通過5'端和/或3'端連接一個(gè)膽固醇分子。
[0018] 所述陽離子脂質(zhì)為三甲基[2, 3_(二亞油烯基氧基）丙基]氯化銨；1，4, 7, 10-四 氮雜環(huán)十二烷，輪環(huán)藤寧；N- (1- (2, 3-二油烯基氧基）丙基）-N，N，N-三甲基氯化銨，DOTMA ; N，N-二甲基-(2, 3-二油烯基氧基）丙胺，DODM ;1，2-二油?；?3-二甲胺丙烷，DODAP ; 雙硬脂基二甲基銨，DSDM ;N，N-二油烯基-N，N-二甲基氯化銨，DODAC ;N-(1-(2, 3-二油酰 基氧基）丙基）-N，N，N-三甲基氯化銨，DOTAP ;N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化銨，DDAB ; 3- (N- (Ν'，Ν' -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基）膽固醇，DC-Cho I; N-(1，2-二肉豆蔻基氧基 丙-3-基）-Ν，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨，DMRIE ;1，2-二亞油基氧基-Ν，N-二甲基氨基 丙烷，DLinDMA ;1，2-二亞麻基氧基-Ν，N-二甲基氨基丙烷，DLenDMA ;Ν4-精胺膽固醇氨基 甲酸酯，GL-67 ;Ν4-亞精胺膽固醇氨基甲酸酯，GL-53,1-(M-精胺）-2, 3-二月桂基甘油氨 基甲酸酯，GL-89中的一種或幾種；
[0019] 優(yōu)選為三甲基[2, 3-(二亞油烯基氧基）丙基]氯化銨、輪環(huán)藤寧、D0TMA、D0TAP、 D0DAP、DLinDMA、DC-Chol 中的一種或幾種。
[0020] 所述三甲基[2, 3-(二亞油烯基氧基）丙基]氯化銨的制備過程在氬氣中進(jìn)行。
[0021] 所述三甲基[2, 3_(二亞油烯基氧基）丙基]氯化銨的結(jié)構(gòu)式如下：
[0022]
[0023] N? N? N-TriMethyI-2? 3-bis[(9Z)-9-0ctadecen-1-yloxy]-1-propanaMiniuM Chloride
[0024] Chemical Formula ：C42H8〇CIN02
[0025] Exact Mass :665. 5878
[0026] Molecular Weight ：666. 5431
[0027] m/z ：665. 5878 (100. 0 % ),666.5911 (45.4 % ),667.5848 (32.0 % )? 668. 5882(14. 5% ) ?667. 5945(10. 1%)?669. 5915(3. 2% ) ?
[0028] 668. 5978(1. 5% )
[0029] Elemental Analysis :C，75. 68 ;H，12. 10 ;G1，5. 32 ;N，2. 10 ;0,4. 80
[0030] 所述磷脂為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、卵磷脂、磷脂酰肌醇和心肌磷脂中的一種 或幾種；
[0031] 所述脂質(zhì)-聚乙二醇為膽固醇聚乙二醇、雙肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1，2-二亞 油酰基-順-甘油-3-磷酸乙醇氨、雙棕櫚?；视途垡叶己碗p硬脂基甘油聚乙二醇中 的一種或幾種。
[0032] 所述T2C1化合物是由1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷和環(huán)氧化合物在90°C反應(yīng)得 到；反應(yīng)時(shí)置于玻璃容器內(nèi)，持續(xù)攪拌，反應(yīng)摩爾比為1:4,反應(yīng)時(shí)長為24-72小時(shí)，優(yōu)選為 28-65小時(shí)。環(huán)氧化合物優(yōu)選環(huán)氧烷基縮水甘油醚（烷基C12-C14)。
[0033] 用于治療乙型病毒性肝炎的RNA干擾組合物的制備方法，包括以下步驟：
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