Nrg1-erbb4復(fù)合體在制備治療心肌缺血的藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因和蛋白的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白I(NRGl)與其酪氨 酸蛋白激酶受體ERBB4的復(fù)合體（NRG1-ERBB4復(fù)合體）的應(yīng)用，特別涉及NRG1-ERBB4復(fù)合 體在制備治療心肌缺血的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，心血管疾病發(fā)病率在全球非傳染性疾病中居首位，具有"發(fā)病率高、致殘 率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多"，即"四高一多"的特點(diǎn)，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的 疾病。盡管近年來(lái)對(duì)心血管疾病的預(yù)防、診斷及治療都有很大的進(jìn)展，其發(fā)病率及死亡率 仍居高不下?，F(xiàn)有的治療方法都有其局限性：如冠狀動(dòng)脈血管重建術(shù)無(wú)法避免心肌損傷， 20-37%的病人中并發(fā)了心肌梗死，逐漸出現(xiàn)心臟功能衰竭等癥狀；而心臟移植術(shù)供體有 限，創(chuàng)傷大，術(shù)后易發(fā)生排斥反應(yīng)等并發(fā)癥。因此，尋求高效、高靶向性、低創(chuàng)、低毒性的治療 方法成了當(dāng)務(wù)之急。
[0003] 干細(xì)胞是一群原始且未分化的細(xì)胞，可自我復(fù)制，在特定條件下，具有分化成其他 種類成熟細(xì)胞的能力，因此又被稱為"萬(wàn)能細(xì)胞"。它們參與胚胎及組織的發(fā)育及成熟過(guò)程， 而對(duì)于組織或器官受損后的修復(fù)或再生，這些自身特點(diǎn)也使得干細(xì)胞成為潛力極大的治療 手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC)在動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)中都顯 示出極大的應(yīng)用潛力和治療效果，是研宄最廣、安全性最好、效果最顯著的干細(xì)胞類型。盡 管MSC的作用機(jī)制尚未被完全闡明，其強(qiáng)大的旁分泌功能在多種疾病中的療效已經(jīng)得到證 實(shí)。MSC可分泌多種營(yíng)養(yǎng)性及具有免疫調(diào)節(jié)活性的因子，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活及 增殖，降低缺血部位的炎癥反應(yīng)，保護(hù)受損的心肌細(xì)胞，招募內(nèi)源性心肌干細(xì)胞進(jìn)行組織修 復(fù)，大大減少了心梗后發(fā)生心肌損傷及功能紊亂的幾率。局部注射MSC的培養(yǎng)上清可顯著 縮小心梗面積，改善左室功能。研宄發(fā)現(xiàn)，MSC分泌的bFGF、VEGF、SDF-l、Angiopoietin_l、 HGF、IGF、PDGF、SFRP、TGF、MMP9等有利于損傷的修復(fù)，是MSC發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵因子。然 而，通過(guò)靜脈系統(tǒng)給入或局部注射的MSC到達(dá)梗死部位后，由于局部缺血缺氧的環(huán)境無(wú)法 提供細(xì)胞存活所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，移植細(xì)胞的存活率低，很大程度上限制了干細(xì)胞的治療作 用。因此，對(duì)MSC進(jìn)行充分改造，使之更能耐受病灶內(nèi)的惡劣環(huán)境，成為今年研宄的熱點(diǎn)之 〇
[0004] 實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)MSC進(jìn)行基因改造可改善細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括存活率，迀移性， 抗凋亡能力等^比如，在MSC中過(guò)表達(dá)Bcl_2(B_cell lymphoma 2)蛋白，可增強(qiáng)移植細(xì)胞 的體內(nèi)存活，有助于心梗后左室功能的恢復(fù)[Figeac，F(xiàn).，et al.，Nanotubular crosstalk with distressed cardiomyocytes stimulates the paracrine repair function of mesenchymal stem cells. Stem Cells，2014. 32 (I) :p. 216-30. ] D 同樣，在 MSC 中過(guò)表達(dá) 促生長(zhǎng)因子l(insulin_like growth factor 1，IGFl)可誘導(dǎo)干細(xì)胞的迀移，促進(jìn)新生血 管形成，從而改善心臟缺血狀態(tài)[Haider，H.，et al.，IGF_l-0verexpressing mesenchymal stem cells accelerate bone marrow stem cell mobilization via paracrine activation of SDF-Ialpha/CXCR4signaling to promote myocardial repair. Circ Res, 2008. 103 (11) :p. 1300-8.]。然而，以往的研宄在目標(biāo)基因的篩選上，只注重該基因?qū)?細(xì)胞本身或體內(nèi)未分化的干細(xì)胞的作用，從未關(guān)注其對(duì)成熟心肌細(xì)胞的影響，而后者亦為 參與心臟修復(fù)和組織再生的重要環(huán)節(jié)，因此，篩選并鑒定出同時(shí)對(duì)移植細(xì)胞本身和成體心 肌細(xì)胞具有保護(hù)作用的關(guān)鍵基因或信號(hào)通路具有更貼近實(shí)際需要的應(yīng)用潛力。
[0005] 最近Bersell等人的研宄發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白I (neuregulinl，NRGl)可 刺激成熟的心肌單核細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期[Bersel 1，K.，et al.，Neuregulinl/ ErbB4signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell, 2009. 138(2) :p. 257-70.]。靶向性地導(dǎo)入NRGl或其酪氨酸蛋白激酶受體ERBB2或 ERBB4對(duì)心梗有保護(hù)作用。NRGl屬于表皮生長(zhǎng)因子家族，通過(guò)與酪氨酸激酶受體ERBB結(jié)合， 介導(dǎo)細(xì)胞接觸及信號(hào)傳遞，在心臟的發(fā)育及成熟過(guò)程中至關(guān)重要。重組人NRGl已被用于慢 性心力衰竭的臨床試驗(yàn)（ClinicalTrials.gov identifiers NCT01131637，NCT01258387)， 在糾正心衰、改善心肌重構(gòu)上初見(jiàn)成效。ERBB2是一個(gè)共受體，不具有配體結(jié)合域， 但可與ERBB4形成ERBB2/ERBB4異二聚體，后者可與配體NRGl結(jié)合并發(fā)揮作用。而 ERBB4除了可以與ERBB2形成異二聚體外，自身亦可形成同二聚體，與其配體NRGl結(jié) 合。NRG1-ERBB通路激活后，可啟動(dòng)下游的PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，分 裂和存活。盡管這些研宄結(jié)果都提示NRGl有望成為治療心梗的有效手段，但亦有其不 足之處：其一，NRGl在體內(nèi)的半衰期極短（約30分鐘），為制定給藥時(shí)間及間歇造成困 難；其二，在成體心臟中只有大約10%的心肌細(xì)胞為單核細(xì)胞，其中只有0. 3%的單核心 肌細(xì)胞對(duì)NRGl刺激產(chǎn)生反應(yīng)，重新進(jìn)入分裂周期[Bersell，K.，et al·，Neuregulinl/ ErbB4signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell, 2009. 138(2) :p. 257-70.];其三，NRGl的刺激呈受體依賴性，靶細(xì)胞是否表達(dá)ERBB受 體決定其是否對(duì)NRGl作出反應(yīng)。因此，如何使NRGl持續(xù)且穩(wěn)定地釋放到病灶局部，是目前 急需解決的重要課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白I(NRGl)與其酪氨酸蛋白激酶受體 ERBB4的復(fù)合體（NRG1-ERBB4復(fù)合體）在制備治療心肌缺血的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明所述的在制備治療心肌缺血的藥物中的應(yīng)用，所述NRG1-ERBB4復(fù)合 體作為基因修飾MSC的靶標(biāo)。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供以NRG1-ERBB4復(fù)合體為靶標(biāo)的治療心肌缺血的藥 物。
[0009] 本發(fā)明所述的藥物是能在病灶局部過(guò)表達(dá)ERBB4,從而反饋性地上調(diào)其配體NRGl 的表達(dá)，形成NRG1-ERBB4-NRG1的自反饋通路的藥物。
[0010] 優(yōu)選地，所述的藥物是ERBB4基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)。該MSC具有增 強(qiáng)的對(duì)缺氧環(huán)境的耐受力，又能在病灶局部過(guò)表達(dá)ERBB4,通過(guò)NRG1-ERBB4-NRG1的自反饋 通路保持病灶局部高水平NRGl的濃度，改善并增強(qiáng)MSC對(duì)于心肌缺血的治療效果。
[0011] 本發(fā)明首次篩選并鑒定出同時(shí)對(duì)移植細(xì)胞本身和成體心肌細(xì)胞具有保護(hù)作 用的關(guān)鍵基因或信號(hào)通路，揭示了 NRGl和ERBB4兩者結(jié)合能夠成為基因修飾MSC的 靶標(biāo)而用于制備治療心肌缺血的藥物。在本發(fā)明中，利用慢病毒系統(tǒng)在MSC中過(guò)表達(dá) ERBB4 (MSC-ERBB4)，反饋性的上調(diào)了其配體NRGl的表達(dá)，不僅提高了移植細(xì)胞在體內(nèi)的存 活率，且MSC-ERBB4通過(guò)上調(diào)NRGl的表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞。藥物的篩選、制備及劑量?jī)?yōu)化一 直是臨床心肌缺血治療的難題之一，在治療心肌缺血的藥物研發(fā)過(guò)程中應(yīng)特別關(guān)注一些對(duì) 成熟心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用的關(guān)鍵性蛋白的影響。本發(fā)明首次證實(shí)了 NRG1-ERBB4-NRG1自 反饋通路的存在，既可增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞本身對(duì)缺氧的耐受力，增高的NRGl又可促進(jìn)成熟 心肌細(xì)胞的增殖。因此，NRG1-ERBB4復(fù)合體可以作為靶標(biāo)，對(duì)于臨床心肌缺血藥物的篩選、 制備及劑量?jī)?yōu)化具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖IA為第