LB/c小鼠（每組3只小鼠）中皮下注射每鼠 IOOng的可溶或者在聚合物囊 泡中的HA，如下：第1天的第1劑量（初次）和第21天的第二劑量（加強）。作為陽性對 照，用500ng的HA和佐劑（完全弗氏佐劑用于初次和不完全弗氏佐劑用于加強，根據(jù)制造 商的指令以1:1體積比制備）免疫一組小鼠，同時用PBS免疫小鼠作為陰性對照。在免疫 前，加強前即刻和加強后一周使用毛細管從小鼠的臉頰采樣來收集血清樣品。
[0085] 免痔晌應(yīng)的宙量
[0086] 在384孔板中涂布15ng/孔的包被緩沖液中的游離HA，在4°C下過夜。第二天，將 孔用PBS洗滌并且在室溫下（RT)在封閉緩沖液（IX PBS中的1% BSA)中封閉lh。每個時 間點的單個小鼠的血清樣品在封閉緩沖液中稀釋（1:100,1:1000或者1:10000)并且在室 溫下在HA包被的或者未包被的孔上孵育Ih (圖7)。洗滌3次后（PBS IX)，在室溫下孵育 HRP偶聯(lián)的抗小鼠 IgG(l :4000) 1小時，隨后洗滌3次。然后用OPD底物定量過氧化物酶活 性。在加強之后（第2次放血）以IOOng HA的等效劑量，HA聚合物囊泡引發(fā)比游離HA更 高的抗體響應(yīng)。
[0087] 總結(jié)
[0088] 在此實施例中，通過使用HA作為模型抗原已證明使用膜蛋白呈遞聚合物囊泡引 發(fā)免疫響應(yīng)的方法。相比于等效免疫劑量的游離HA，HA聚合物囊泡能夠更有效地引發(fā)抗體 響應(yīng)。膜蛋白抗原呈遞聚合物囊泡可以潛在地用于疫苗接種來誘導保護性免疫響應(yīng)，以及 用于產(chǎn)生以其他方式難以誘導的針對膜蛋白質(zhì)的抗體。
[0089] 此外，本發(fā)明人已使用CXCR4聚合物囊泡引發(fā)針對CXCR4的抗體從而證明可以為 通過體外合成插入周膜內(nèi)的膜蛋白抗原產(chǎn)生抗體。
[0090] 利用流感病毒（同株）的血凝抑制和微量中和測定法測試本工作中產(chǎn)生的抗體的 功能性正在開展以證明它們能夠中和病毒。
[0091] 目前也正在研宄的是在該研宄中產(chǎn)生的針對CXCR4聚合物囊泡的抗體是否對細 胞中產(chǎn)生的CXCR4抗原具有更特異的親和力以證明這可以用作產(chǎn)生針對膜蛋白抗原的抗 體的工具。
[0092] "包含"是指包括但不限于跟隨詞語"包含"的任何事物。因此，使用術(shù)語"包含" 表示所列要素是需要的或強制性的，但其它要素是任選的，并且可以或可以不存在。
[0093] "由......組成"是指包括并且限于跟隨短語"由......組成"的任何事物。因 此，短語"由......組成"表示所列要素是需要的或強制性的，并且沒有其它要素可以存 在。
[0094] 本文示例性描述的發(fā)明可以在不存在本文沒有特別公開的任何一種或多種要 素，一種或多種限制的情況下合適地實施。因此，例如，術(shù)語"包含（comprising)"，包括 (including) "，"含有（containing) "等術(shù)語應(yīng)被寬泛和非限制性地理解。另外，本文所使 用的術(shù)語和表達已經(jīng)被用作描述的術(shù)語而不是限制，并且無意在這些術(shù)語和表達的使用中 排除顯示和表達的特征及其部分的任何等價物，但是已經(jīng)認識到各種改變在請求保護的本 發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)當理解，雖然本發(fā)明已通過優(yōu)選的實施方式和任選的特征特別地公 開，本文公開的其中體現(xiàn)的本發(fā)明的修改和改變可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員采取，而且這些 修改和改變被認為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0095] 與給定數(shù)字值相關(guān)的"約"，例如用于溫度和時間周期，意思是包括規(guī)定值的10% 內(nèi)的數(shù)值。
[0096] 本文已經(jīng)廣泛地和一般性地描述本發(fā)明。落入一般性公開范圍內(nèi)的每個更窄的種 類和子類分組也形成本發(fā)明的一部分。這包括從種類去除任何主題的帶有附帶條件或負面 限制的本發(fā)明的一般描述，不管去除的物質(zhì)是否在本文中具體記載。
[0097] 其他的實施方案都在下面的權(quán)利要求和非限制性實施例內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特 征或方面以馬庫什組的方式描述的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到本發(fā)明也由此就馬 庫什組的任何個體成員或成員的亞組來描述。
【主權(quán)項】
1. 一種用于在受試者中引發(fā)對免疫原的免疫響應(yīng)的方法，包括用組合物注射所述受試 者，所述組合物包含具有兩親聚合物的周膜的聚合物囊泡載體和整合到所述聚合物囊泡載 體的所述兩親聚合物的周膜內(nèi)的免疫原，其中，所述免疫原為膜相關(guān)蛋白或脂質(zhì)抗原。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述注射包括皮內(nèi)，腹腔內(nèi)，皮下，靜脈內(nèi)或肌 內(nèi)，或非侵入性給藥。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述膜相關(guān)蛋白是跨膜蛋白，G蛋白偶聯(lián)受 體，神經(jīng)遞質(zhì)受體，激酶，孔蛋白，ABC轉(zhuǎn)運體，離子轉(zhuǎn)運體，乙酰膽堿受體，或細胞粘附受體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫原為合成脂質(zhì)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫原為天然脂質(zhì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項所述的方法，其中，所述兩親聚合物包含二嵌段或三 嵌段（A-B-A或A-B-C)共聚物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述兩親聚合物包括羧酸，酰胺，胺，亞烷基，二 烷基硅氧烷，醚或亞烷基硫化物中的至少一種單體單元。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述兩親聚合物是從低聚（氧化乙烯）嵌段，聚 (氧化乙烯）嵌段，低聚（氧化丙烯）嵌段，聚（氧化丙烯）嵌段，低聚（氧化丁烯）嵌段和 聚（氧化丁烯）嵌段組成的組中選擇的聚醚嵌段。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述兩親聚合物是聚（丁二烯）-聚（環(huán)氧乙烷） (PB-PEO)二嵌段共聚物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述PB-PEO二嵌段共聚物包括5-50個嵌段PB 和5-50個嵌段PE0。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中的任一項所述的方法，其中，所述聚合物囊泡載體包含一個 或多個隔室。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述一個或多個隔室中的每一個封裝肽，蛋白 質(zhì)和核酸中的至少一種。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述肽，蛋白質(zhì)和核酸中的至少一種是免疫原 性的。14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述的方法，其中，所述一個或多個隔室中的每一 個由相同或不同的兩親聚合物組成。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，兩種或更多種不同的免疫原被整合到所述兩 親聚合物的周膜內(nèi)。16. 根據(jù)權(quán)利要求11至15中的任一項所述的方法，其中，所述聚合物囊泡載體包含不 只一個隔室，其中，所述隔室包括外嵌段共聚物囊泡和至少一個內(nèi)嵌段共聚物囊泡，其中， 所述至少一個內(nèi)嵌段共聚物囊泡被封裝在所述外嵌段共聚物囊泡內(nèi)。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述外嵌段共聚物囊泡是由從聚[苯乙 稀Hd-聚（L-異氛基丙氨酸（2-噻吩-3-基-乙基）酰胺）](PS-PIAT)，聚（丁二稀）-聚 (環(huán)氧乙烷）（PBD-PE0)，聚（環(huán)氧乙烷）-聚（己內(nèi)酯）（PE〇-PCL)，聚（乙基乙烯）-聚 (環(huán)氧乙烷）（PEE-PEO)，聚（環(huán)氧乙烷）-聚（乳酸）（PEO-PLA)，聚（異戊二烯）-聚（環(huán) 氧乙烷）（PI-PEO)，聚（2-乙烯基吡啶）-聚（環(huán)氧乙烷）（P2VP-PE0)，聚（環(huán)氧乙烷）-聚 (N-異丙基丙烯酰胺）（PEO-PNIPAm)，聚（苯乙烯）-聚（丙烯酸）（PS-PAA)，聚（乙二 醇）_聚（硫化丙烯）（PEG-PPS)，聚（2-甲基惡唑啉）-聚（二甲基硅氧烷）-聚（2-甲基 惡唑啉）（PMOXA-PDMS-PMOXA)，聚（環(huán)氧乙烷）-聚（二甲基硅氧烷）-聚（2-甲基惡唑啉） (PEO-PDMS-PMOXA)，和聚（甲基苯基硅烷）-聚（環(huán)氧乙烷）（PMPS-PEO-PMPS-PEO-PMPS)組 成的組中選擇的共聚物形成的聚合物囊泡。18. 根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中，所述至少一個內(nèi)嵌段共聚物囊泡是由從 聚[苯乙稀-b_聚（L-異氛基丙氨酸（2-噻吩-3-基-乙基）酰胺）](PS-PIAT)，聚（丁 二烯）_聚（環(huán)氧乙烷）（PBD-PEO)，聚（環(huán)氧乙烷）-聚（己內(nèi)酯）（PEO-PCL)，聚（乙基 乙烯）_聚（環(huán)氧乙烷）（PEE-PEO)，聚（環(huán)氧乙烷）-聚（乳酸）（PEO-PLA)，聚（異戊二 烯）_聚（環(huán)氧乙烷）（PI-PEO)，聚（2-乙烯基吡啶）-聚（環(huán)氧乙烷）（P2VP-PE0)，聚（環(huán)氧 乙烷）-聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PEO-PNIPAm)，聚（苯乙烯）-聚（丙烯酸）（PS-PAA)，聚 (乙二醇）-聚（硫化丙烯）（PEG-PPS)，聚（2-甲基惡唑啉）-聚（二甲基硅氧烷）-聚（2-甲 基惡唑啉）（PMOXA-PDMS-PMOXA)，聚（環(huán)氧乙烷）-聚（二甲基硅氧烷）-聚（2-甲基惡唑 啉）（PEO-PDMS-PMOXA)，和聚（甲基苯基硅烷）-聚（環(huán)氧乙烷）（PMPS-PEO-PMPS-PEO-PMPS) 組成的組中選擇的共聚物形成的聚合物囊泡。19. 一種用于免疫原的皮內(nèi)，腹腔內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，或靜脈內(nèi)注射，或非侵入性給藥的組 合物，其包含具有兩親聚合物的周膜的聚合物囊泡載體和整合到所述聚合物囊泡載體的所 述兩親聚合物的周膜內(nèi)的免疫原，其中，所述免疫原是膜相關(guān)蛋白或脂質(zhì)抗原。20. -種組合物在抗體發(fā)現(xiàn)，疫苗發(fā)現(xiàn)，或靶向遞送中的用途，其中，所述組合物包含具 有兩親聚合物的周膜的聚合物囊泡載體和整合到所述聚合物囊泡載體的所述兩親聚合物 的周膜內(nèi)的免疫原，其中，所述免疫原是膜相關(guān)蛋白或脂質(zhì)抗原。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于引發(fā)對免疫原的免疫響應(yīng)的方法，特別是，涉及使用聚合物囊泡作為免疫原的載體的這樣的方法。
【IPC分類】A61K9/10
【公開號】CN104936579
【申請?zhí)枴緾N201380070982
【發(fā)明人】馬達范·納拉尼, 法比安·德卡約, 傅智康, 蘇杏芳
【申請人】新加坡科技研究局
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2013年11月11日
【公告號】EP2919758A1, WO2014077781A1