一種用于肺癌的藥物組合物的制作方法
【專利說明】-種用于肺癌的藥物組合物
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本申請(qǐng)涉及一種用于肺癌的藥物組合物，具體地涉及苦鬼白毒和厄洛替尼聯(lián)合使 用在在人肺癌疾病中的應(yīng)用，其屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來許多國家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率 均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚 不完全明確，大量資料表明，長(zhǎng)期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。已有的研宄證 明：長(zhǎng)期大量吸煙者患肺癌的概率是不吸煙者的10~20倍，開始吸煙的年齡越小，患肺癌的 幾率越高。此外，吸煙不僅直接影響本人的身體健康，還對(duì)周圍人群的健康產(chǎn)生不良影響， 導(dǎo)致被動(dòng)吸煙者肺癌患病率明顯增加。城市居民肺癌的發(fā)病率比農(nóng)村高，這可能與城市大 氣污染和煙塵中含有致癌物質(zhì)有關(guān)。因此應(yīng)該提倡不吸煙，并加強(qiáng)城市環(huán)境衛(wèi)生工作。
[0004] 肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，也是目前對(duì)人類健康與生命構(gòu)成威脅最大的 惡性腫瘤。在許多國家，肺癌是首位癌癥致死原因，給患者及家庭造成了極大痛苦。肺癌由 遺傳和環(huán)境等諸多因素相互作用所致，其發(fā)展是一個(gè)多步驟過程，涉及大量基因結(jié)構(gòu)和表 達(dá)調(diào)控的改變。
[0005] PPP(苦鬼臼毒）作為靶向IGF1R的小分子抑制劑，研宄發(fā)現(xiàn)能增加肺癌細(xì)胞放療 敏感性，II期臨床試驗(yàn)表明其聯(lián)合化療較單獨(dú)化療病人的生存期顯著延長(zhǎng)，其中78%的鱗 癌及57%的腺癌患者從中獲益。PPP現(xiàn)已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，但目前研宄僅局限于其是否能 增加肺癌放化療敏感性方面，PPP是否能逆轉(zhuǎn)肺腺癌EGFR-TKI耐藥目前尚未見報(bào)道。
[0006] 最新研宄發(fā)現(xiàn)肺癌中EGFR及IGF1R信號(hào)通路相互作用，且是通過Ras/Raf/MAPK 途徑來實(shí)現(xiàn)其協(xié)同作用的。轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者對(duì)于EGFR單抗（西妥昔單抗）的療效，在 IGF1R高表達(dá)者中較好。Y.J.Choi等發(fā)現(xiàn)在EGFR-TKI原發(fā)性耐藥肺癌細(xì)胞株H1650中， IGF1R小分子酪氨酸激酶抑制劑a-IR3及AG1024能增加吉非替尼抗腫瘤細(xì)胞增殖及促凋 亡作用，并能下調(diào)磷酸化Akt，提示其能拮抗EGFR-TKI原發(fā)性耐藥。
[0007] 伴隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)的不斷發(fā)展，特別是系統(tǒng)生物學(xué)的出現(xiàn)，人們提出了 多組分藥物的概念。多組分藥物是一種給藥方案，區(qū)別在于只包含一個(gè)化合物的單靶點(diǎn)藥 物，其包含多種具有協(xié)同藥理學(xué)作用的化合物，能同時(shí)對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行干擾，使總效應(yīng)大于 各單效應(yīng)之和，以達(dá)到最佳的治療效果。與單組分抗癌藥物相比，多組分抗癌藥物在治療時(shí) 會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使得總效應(yīng)大于各單效應(yīng)之和，進(jìn)而具有增強(qiáng)藥效的特點(diǎn)。此外，多組分 藥物還具有降低藥物毒性和不易引起耐藥性的優(yōu)勢(shì)。
[0008] 肺癌的靶向治療在綜合治療中占據(jù)重要部分，厄洛替尼作為EGFR小分子酪氨酸 激酶抑制劑，因其有口服簡(jiǎn)便、副作用小、易于被患者接受而臨床應(yīng)用廣泛。目前研宄的 肺癌生物標(biāo)志非常多，如：EGFR、VEGFR、PDGFR、C-KIT、PI3K、RAS/RAF/MEK/ERK、mTOF、COX、IGF1R或PKC等。針對(duì)這些基因的靶向治療在臨床治療中顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，大大提高了 患者的生活質(zhì)量及總生存期。其中靶向EGFR藥物如吉非替尼、厄洛替尼等在肺腺癌治療中 最為成功。但是研宄顯示50%的肺腺癌患者經(jīng)過EGFR-TKI治療有效6-12個(gè)月后出現(xiàn)獲得 性耐藥。其耐藥原因有很多，主要概括為以下幾方面：（1)EGFR基因突變或靶點(diǎn)缺失，常常 與第二位點(diǎn)I790M突變相關(guān)；（2)Met擴(kuò)增；（3)胞內(nèi)EGFR下游信號(hào)蛋白激活；（4)繞開EGFR 通路的其他TK受體的活化，如IGF1R、VEGFR、TOGFR等；（5)腫瘤誘導(dǎo)的血管生成。其中有 部分耐藥機(jī)制尚未被完全闡明。因此有必要針對(duì)這些耐藥原因?qū)ふ彝黄?，闡明其機(jī)制，并積 極尋找新的分子靶向治療藥物來阻止或延遲其耐藥。在此，我們選用厄洛替尼誘導(dǎo)建立耐 藥株，建立其相應(yīng)的耐藥移植瘤裸鼠模型，尋找PPP對(duì)厄洛替尼耐藥裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影 響，進(jìn)而提供一種藥效好、耐藥性低的抗肺腫瘤的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種不具有耐藥性、協(xié)同作用明顯的肺癌活性物質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明所提供的一種具有抗癌活性的活性物質(zhì)，其由PPP和厄洛替尼組成。
[0011] 具體地，上述抗肺癌活性成分中PPP和厄洛替尼的重量份比為1 : 36~1 : 1.0。
[0012] 進(jìn)一步地，上述抗肺癌活性成分中PPP和厄洛替尼的重量份優(yōu)選比為1 : 25~1 : 4〇
[0013] 具體地，上述抗肺癌活性成分中PPP和厄洛替尼的重量份比為1 : 16~1 : 10。
[0014] 本發(fā)明還提供了上述PPP和厄洛替尼在肺癌疾病中的應(yīng)用。
[0015] 上述PPP(Picropodophyllotoxin)即為苦鬼白毒素?？喙戆锥舅厥切￠蘅浦参锇?角蓮Dysosmaversipellis(Hance. )M.Cheng的根莖，其系統(tǒng)命名法為：（51?，533,831?，91?)-5, 8, 8a, 9-Tetrahydr〇-9-hydroxy-5-(3, 4, 5-trimethoxyphenyl)furo[3' ,4' :6,7]naph tho[2, 3_d]-1，3-dioxol_6(5aH)_one〇
[0016]膜島素樣生長(zhǎng)因子受體 1 (Insulin-likegrowthfactorreceptor1，IGF1R)作 為EGFR的旁路通道，是酪氨酸激酶家族的一員，目前研宄顯示已在許多惡性腫瘤如肺癌， 乳腺癌，肝癌，大腸癌，前列腺癌等組織中均表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移 系密切，還能與其他細(xì)胞因子相互作用促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。IGF1R定位于15q26染色體，DNA全 長(zhǎng)約100kb，21個(gè)外顯子，為單核基因，編碼1367個(gè)氨基酸前體蛋白，屬于受體酪氨酸激酶 (RTK)成員。它是一個(gè)跨膜受體，在各種類型細(xì)胞上均有表達(dá)。IGF-IR整體結(jié)構(gòu)包括3個(gè) 部分：細(xì)胞外；跨膜區(qū)；酪氨酸蛋白激酶區(qū)（即胞漿區(qū)），是一種糖蛋白異四聚體，由兩個(gè)a 亞基（配體結(jié)合區(qū)，707個(gè)氨基酸）及兩個(gè)0亞基（跨膜及胞內(nèi)區(qū)，626個(gè)氨基酸）組成。 其通過與IGF-II結(jié)合從而發(fā)揮作用。IGF-II與IGF1R的胞外域結(jié)合后引起跨膜0亞基結(jié) 構(gòu)的改變，0亞基內(nèi)酪氨酸激酶即被激活產(chǎn)生自身磷酸化，使下游底物如胰島素受體底物 (Insulinereceptorsubstrates,IRS)、Src同源膠原（Srchomologycollagen,She)等 發(fā)生磷酸化作用，從而啟動(dòng)磷醋酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol3kinase,PI3K)/ 蛋白激酶B(ProteinkinaseB,PKB)或Ras/促分裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated proteinkinase，MAPK)信號(hào)通路，將細(xì)胞生長(zhǎng)增殖信號(hào)持續(xù)傳至細(xì)胞核，使細(xì)胞周期調(diào)節(jié) 失控，加速細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)有絲分裂、細(xì)胞表型惡性轉(zhuǎn)化、抗凋亡和誘導(dǎo)血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表達(dá)等，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā) 展。
[0017]IGF1R作為酪氨酸激酶家族的一員，目前已證實(shí)其通過其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肺癌的 發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。抑制IGF-IR的活性，可以有效控制肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)肺癌 對(duì)化療、放療的敏感性。抑制IGF1R信號(hào)通路還可以通過下調(diào)VEGFR的表達(dá)來抑制血管生 長(zhǎng)，從而控制肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。IGF1R也早已經(jīng)成為特異性治療肺癌的熱點(diǎn)靶標(biāo)。目前 以IGF1R為靶點(diǎn)的治療方法有許多，包括反義寡核苷酸技術(shù)、RNA干擾、單克隆抗體及小分 子激酶抑制劑等。小分子抑制劑是目前臨床研宄應(yīng)用最為廣泛。
[0018] 我們?cè)诩?xì)胞水平通過構(gòu)建厄洛替尼耐藥人肺腺癌細(xì)胞模型PC-9/ER，觀察單用 EGFR酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼或聯(lián)合IGF1R酪氨酸激酶抑制劑PPP作用于該細(xì)胞后，該 細(xì)胞對(duì)厄洛替尼耐藥性的影響。然后通過建立相應(yīng)的耐藥裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分為對(duì)照 組、厄洛替尼組、PPP組、PPP及厄洛替尼聯(lián)合組，檢測(cè)各組移植瘤體積、重量及計(jì)算抑瘤率。 通過【具體實(shí)施方式】的實(shí)驗(yàn)條件成功構(gòu)建人肺腺癌厄洛替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9/ER，同時(shí)得到 在親代及耐藥細(xì)胞系，厄洛替尼聯(lián)合PPP組均較其他組更能顯著的抑制細(xì)胞增殖；此外通 過WesternBlot法結(jié)果表明聯(lián)合用藥組EGFR下游磷酸化的Akt、ERK的表達(dá)水平明顯減 少，厄洛替尼與PPP聯(lián)用能有效抑制Akt的激活，IGF1R信號(hào)通路影響Akt磷酸化在耐藥 細(xì)胞中發(fā)揮更為重要的作用，IGF1R抑制劑PPP通過間接抑制下游靶基因磷酸化而影響細(xì) 胞增殖。
[0019] 本發(fā)明所提供的抗肺癌活性物質(zhì)由PPP和厄洛替尼共同組成，其中通過細(xì)胞及裸 鼠模型、發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤的效果優(yōu)異，同時(shí)不產(chǎn)生耐藥性。
【附圖說明】
[0020] 圖1不同組別PC-9和PC-9/ER細(xì)胞存活率； 圖2PC-9/ER細(xì)胞中Akt、ERK、p-Akt及p-ERK蛋白表達(dá)水平； 圖3給予不同藥物后各組裸鼠移植瘤形態(tài)比較； 圖4給予不同藥物后各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下通過具體實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)的技術(shù)方案作詳細(xì)的解釋，但所述
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限 于此。
[0022] 本發(fā)明通過人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C-9,建立厄洛替尼耐藥株P(guān)C-9/ER，觀察對(duì)照組、厄 洛替尼組、PPP組、厄洛替尼聯(lián)合PPP組的細(xì)胞增殖情況；細(xì)胞水平分析PPP逆轉(zhuǎn)厄洛替尼 耐藥；WesternBlot分析細(xì)胞中p-EGFR、p-IGFlR及下游AKT、ERK、p-AKT及p-ERK的表達(dá)； 探討逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥發(fā)生的機(jī)制。然后構(gòu)建厄洛替尼耐藥肺腺癌裸鼠移植瘤模型，觀察 對(duì)照組、厄洛替尼組、PPP組、厄洛替尼聯(lián)合PPP組的裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，計(jì)算抑瘤率，進(jìn)一 步證實(shí)PPP逆轉(zhuǎn)耐藥。
[0023] 以細(xì)胞培養(yǎng)、構(gòu)建耐藥株、Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)以及CCK8等細(xì)胞學(xué)及分子生 物學(xué)方法，從分子水平揭示了IGF1R通路與肺腺癌EGFR-TKI獲得性耐藥的關(guān)系，進(jìn)而使得 PPP聯(lián)合厄洛替尼在肺癌疾病中有廣泛的應(yīng)用。
[0024] 1細(xì)胞研宄（體外實(shí)驗(yàn)） 1. 1主要試劑 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS)、胰酶均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同 仁公司；Akt、ERK及磷酸化Akt、ERK抗體均購自美國sigma公司；PPP由南通大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床研宄中心饋贈(zèng)；厄洛替尼購自聯(lián)科生物有限公司。PPP及厄洛替尼溶解于DMS0,制成濃 度為10ymol/L的溶液，分裝后保存于-20°C冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至目標(biāo)濃 度，使其DMS0體積分?jǐn)?shù)〈0. 005%。
[0025] 1. 2CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 CCK8法測(cè)定各組對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥細(xì)胞接種于96孔 培養(yǎng)板內(nèi)，24h后各組分別加入培養(yǎng)液，PPP(5ymol/L)，厄洛替尼150ymol/L，厄洛替尼 加PPP(厄洛替尼為150ymol/L，PPP為5ymol/L)，48h后向每孔加入10yLCCK-8溶 液，繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育2h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處吸光度，分析