2 ~5 U、0. 02 ~4 U、0. 02 ~2 U、0. 02 ~1 U、0. 02 ~0. 5 U、0. 02 ~0. 1 U、0. 02 ~ 0. 05 U、0. 05 ~5 U、0. 05 ~2 U、0. 05 ~1 U、0. 05 ~0. 5 U、0. 05 ~0. 1 U、0. 1 ~5 U、 0? 1 ~4 U、0. 1 ~2 U、0. 1 ~1 U、0. 1 ~0? 5 U、0. 5 ~5 U、0. 5 ~4 U、0. 5 ~1 U、1 ~5 U、1~4 U、1~2 U、2~5 U、2~4 U、4~5 U的范圍： 本發(fā)明的治療劑的給予次數(shù)可以是1天1次，也可以是1天2~4次或者是分成更多 次給予，可以根據(jù)需要每天或在適當(dāng)?shù)奶鞌?shù)內(nèi)以必要的期間給予進(jìn)行上述給予。
[0061] 本發(fā)明的治療藥的適用對(duì)象只要是瘢痕疙瘩和/或增生性瘢痕即可，沒(méi)有特別限 定，可廣泛應(yīng)用于真性瘢痕疙瘩、瘢痕性瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、成熟瘢痕（例如，可例舉青 春痘痕等）等。 實(shí)施例
[0062] 以下根據(jù)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。
[0063] [參考例1]瘢痕疙瘩病變部位與正常皮膚部位的觀察 由瘢痕疙瘩患者中摘除含有瘢痕疙瘩病變部位和正常皮膚部位的人組織檢樣作為組 織材料。將檢樣用4%多聚甲醛在4°C下固定24小時(shí)，然后石蠟包埋，制備石蠟塊，制備3 的石蠟切片。脫石蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE)染色、彈性van Gieson (EVG)染色，制 備標(biāo)本。使用顯微鏡觀察瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織。
[0064] 結(jié)果如圖1所示。用線標(biāo)示的部分是瘢痕疙瘩病變部位，相鄰的部分為正常皮膚 部位。通過(guò)EVG染色，在瘢痕疙瘩病變部位以外的正常皮膚部位可以確認(rèn)被染色為黑色的 彈性纖維結(jié)構(gòu)（箭頭），瘢痕疙瘩病變部位的大部分可見(jiàn)透明化，可以確認(rèn)彈性纖維結(jié)構(gòu)形 成缺失。
[0065] [參考例2]瘢痕疙瘩病變組織與正常皮膚組織中彈性纖維構(gòu)成成分的mRNA表達(dá) 由人檢樣中摘除瘢痕疙瘩病變組織（4名）和正常皮膚組織（3名）作為組織材料。使 用RNeasy Plus試劑盒（株式會(huì)社_ /y >制備），由瘢痕疙瘩組織、正常皮膚組織中提取 總RNA。使用advantage RT for PCR試劑盒（日本< 外> 7 _ y y >株式會(huì)社制 備），由1 # g總RNA中合成cDNA，對(duì)于彈性纖維構(gòu)成成分的7種蛋白，通過(guò)RT-PCR研宄其 mRNA的表達(dá)。PCR中使用的引物如表1所示。
[0066] 使用Blend Taq-plus (注冊(cè)商標(biāo)）（東洋紡織株式會(huì)社制備）進(jìn)行PCR，擴(kuò)增特 異性序列，通過(guò)電泳確認(rèn)。PCR的條件是變性94°C 30秒、退火58°C 30秒、延伸72°C 1分鐘。 DANCE、MFAP-2、GAPDH是進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，原彈性蛋白、原纖蛋白-1、纖維蛋白-UEMILIN是 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
[0067] 結(jié)果如圖2所示，參考例1中顯示了在瘢痕疙瘩病變部位彈性纖維結(jié)構(gòu)無(wú)法確認(rèn)。 本試驗(yàn)中，以彈性纖維的主要成分一彈性蛋白為代表，原纖蛋白-1等彈性纖維構(gòu)成成分的 mRNA在瘢痕疙瘩組織中也以與正常組織同等水平表達(dá)。這顯示瘢痕疙瘩組織中彈性纖維結(jié) 構(gòu)的缺失不是由于彈性蛋白、原纖蛋白-1等的產(chǎn)生減少。
[0068][參考例3]瘢痕疙瘩組織中彈性蛋白與原纖蛋白-1蛋白的表達(dá) 參考例2中顯示了瘢痕疙瘩組織中的正常水平的彈性蛋白、原纖蛋白-1的mRNA的表 達(dá)。接著，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色研宄彈性蛋白、原纖蛋白-1的蛋白質(zhì)水平的表達(dá)和在胞 外基質(zhì)中的局部存在。順序如下。
[0069] 彈性蛋白染色：切斷人瘢痕疙瘩組織，使用4%多聚甲醛在4°C下固定24小時(shí)。然 后石蠟包埋，制備6 的切片。脫石蠟后通過(guò)LSAB/HRP試劑盒（久' 3 9々A y株式會(huì) 社制備）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。使用抗彈性蛋白抗體（1:100,工7只千>7° 口夂夕7公 司制備，PR533)作為一次抗體。
[0070] 原纖蛋白-1染色：切斷人瘢痕疙瘩組織，立即包埋在OCT冰凍切片包埋劑（0. C. T. Compound)中進(jìn)行冷凍。制備10 冷凍切片，用Block Ace進(jìn)行封閉，然后用抗原纖蛋 白-1抗體（1:200,冬才Y-力一公司制備）與其反應(yīng)。二次抗體使用了 Alexa Fluor 546 山羊抗兔IgG抗體（1:800,壬U i 7 -7?？?一7'、公司制備）。用煙酸己可堿（Hoechst) (シクY公司制備）進(jìn)行細(xì)胞核染色。
[0071] 結(jié)果如圖2B所示。通過(guò)煙酸己可堿染色被染色的部分顯示在細(xì)胞核的局部存在， 即細(xì)胞的局部存在，細(xì)胞的間隙存在胞外基質(zhì)。彈性蛋白染色中，可以確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)的彈性蛋 白的表達(dá)（箭頭），但在胞外基質(zhì)中未見(jiàn)纖維狀的染色圖像（以舉例給出了胞外基質(zhì)的 一個(gè)部位）。在原纖蛋白-1染色中，與正常皮膚同樣，在胞外基質(zhì)中可見(jiàn)纖維狀的染色圖 像。
[0072] 這些顯示，在瘢痕疙瘩患者病變部位的細(xì)胞中，同時(shí)產(chǎn)生了彈性蛋白和原纖蛋 白-1，但是在胞外基質(zhì)中未見(jiàn)彈性蛋白在原纖蛋白-1上的沉積，彈性纖維結(jié)構(gòu)缺失。產(chǎn)生 的彈性蛋白分泌在胞外基質(zhì)中，但是未作為彈性纖維與原纖蛋白-1締合?沉積，因此可認(rèn) 為從瘢痕疙瘩組織中代謝?消失。
[0073][參考例4]蓄積在瘢痕疙瘩組織中的CS的分析 對(duì)瘢痕疙瘩組織和正常皮膚的CS蓄積量進(jìn)行了比較。對(duì)蓄積在瘢痕疙瘩組織中的CS 的種類也進(jìn)行了研宄。
[0074] 方法是與參考例3同樣，將所得的瘢痕疙瘩組織切片（6 #m)和正常皮膚組織 切片（6 #m)脫石蠟，然后未處置或進(jìn)行了各種CSase處理，然后進(jìn)行了愛(ài)茜藍(lán)染色（pH 2.5)。愛(ài)茜藍(lán)是對(duì)組織中的GAG進(jìn)行染色的色素。將CSase-ABC (來(lái)自普通桿菌，生化學(xué) 工業(yè)株式會(huì)社制備）、CSase-B (來(lái)自肝素黃桿菌，生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制備）、CSase-AC (來(lái)自肝素黃桿菌，生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制備）分別用〇. lmol Tris-HCl緩沖液溶解，使?jié)?度為ImU/l #1，在37°C下對(duì)組織切片進(jìn)行了 2小時(shí)處理，然后用愛(ài)茜藍(lán)液（pH 2. 5)進(jìn)行 了染色。
[0075] 結(jié)果如圖3所示。左側(cè)的兩張圖是CSase未處置的瘢痕疙瘩組織切片（下圖）和 正常皮膚組織切片（上圖）的愛(ài)茜藍(lán)染色照片。與正常皮膚組織相比，可知瘢痕疙瘩組織 的染色性強(qiáng)，在瘢痕疙瘩病變部位的胞外基質(zhì)中蓄積GAG。而右側(cè)的三張照片是將瘢痕疙瘩 組織切片進(jìn)行CSase-ABC、CSase-B、CSase-AC處理后進(jìn)行了愛(ài)茜藍(lán)染色的照片。三種酶處 理后均比左側(cè)下圖的瘢痕疙瘩組織（未進(jìn)行酶處理）的愛(ài)茜藍(lán)染色性低，但在CSase-ABC 處理中，可確認(rèn)到染色性降低至與正常皮膚同等的水平。
[0076] [參考例5] CS對(duì)于彈性纖維再生的影響 由參考例4的結(jié)果顯示：通過(guò)過(guò)量蓄積的CS，發(fā)生瘢痕疙瘩組織中的彈性纖維形成的 缺失（抑制彈性蛋白在原纖蛋白上的沉積）。因此，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)（工7只卜9I冬シ只 7 7七 < )中，人為地將CS-A、CS-B或CS-C單獨(dú)以及各種CS組合得到的CS對(duì)來(lái)自患者的 瘢痕疙瘩細(xì)胞進(jìn)行處理，研宄了最能引起彈性纖維結(jié)構(gòu)缺失（抑制胞外基質(zhì)中的彈性蛋白 的沉積）的CS的組合。
[0077] 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中插入直徑13 mm的培養(yǎng)板7年株式會(huì)社制備），以 1 X 104/孔在該板上接種用explant法由人瘢痕疙瘩組織中采集的瘢痕疙瘩細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)基（年7'' 3公司制備）培養(yǎng)。CS添加組是設(shè)定CS-A、CS-B和CS-C單獨(dú)以及各種CS 組合的添加組。培養(yǎng)基中每隔2天分別將400 #g/ml上述3種CS單獨(dú)或者將它們組合， 添加1 ml。對(duì)照是不添加任何成分進(jìn)行培養(yǎng)（未添加組）。第9天取出培養(yǎng)板，用100%甲 醇固定，用2%BSA固定，然后用抗彈性蛋白抗體（1:100,工歹只于>7° 口久' 夕7公司制備， PR533)、抗原纖蛋白-1抗體（1:200,工歹?？诰?夕7公司制備，PR217)作為一次抗 體，與其進(jìn)行反應(yīng)。二次抗體是使用Alexa Fluor 546山羊抗兔IgG抗體（1:200,壬U i 口一7''公司制備），用煙酸己可堿公司制備）進(jìn)行了細(xì)胞核染色。然后通 過(guò)共焦激光顯微鏡系統(tǒng)（株式會(huì)社二3 y制備，Digital Eclipse Clsi)觀察，獲得圖像。 然后使用圖像分析軟件（Image pro)進(jìn)行了彈性蛋白染色的圖像分析。進(jìn)行圖像的灰階校 正、圖像反轉(zhuǎn)，與核染色圖像比對(duì)，同時(shí)設(shè)定范圍，可以提取不含有核染色區(qū)域的染色范圍， 測(cè)定彈性蛋白染色部分的面積。所得的值以相對(duì)于CS未添加組的相對(duì)百分比表示（%)，其 中CS未添加組為100%。
[0078] 圖4表示CS未添加組的彈性蛋白染色和原纖蛋白-1染色照片。染色為橢圓形的 部分表示為煙酸己可堿染色的細(xì)胞核的部位、即細(xì)胞的局部存在，細(xì)胞間隙表示胞外基質(zhì) 的部分。CS未添加組中確認(rèn)到胞外基質(zhì)中的彈性蛋白的沉積（左圖：白箭頭）、原纖蛋白-1 (右圖：白箭頭）的纖維結(jié)構(gòu)。通過(guò)圖像分析軟件分析各種CS添加組的結(jié)果，將該結(jié)果用圖 表表示（圖5和表2)。在CS-A、CS-B和CS-C單獨(dú)，或?qū)S-A、CS-B和CS-C的兩種組合得 到的CS中，與CS未添加組相比，可見(jiàn)抑制了胞外基質(zhì)中若干纖維性彈性蛋白沉積，在同時(shí) 添加CS-A、CS-B和CS-C三種的組