重組融合蛋白制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及穩(wěn)定的重組融合蛋白制劑及其制備 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD)又稱(chēng)老年黃斑變性，為視網(wǎng)膜黃斑區(qū)結(jié)構(gòu)的衰老性改 變，主要由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜退行性病變引起的不可逆的視力下降或喪失。該 病在臨床上分為干性（萎縮性）AMD和濕性（滲出性）AMD兩種，其中，濕性AMD約占AMD總 病例數(shù)的20%，不過(guò)，在西方國(guó)家，濕性AMD卻是老年人失明的首要原因。眼內(nèi)異常血管增 生是濕性AMD發(fā)生和發(fā)展的主要原因之一，阻斷異常血管增生是濕性AMD的治療基礎(chǔ)，它有 可能減緩甚至阻止疾病的進(jìn)程。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)是一種分泌性蛋白質(zhì)，它可誘發(fā) 血管生成，增加血管滲透性，引發(fā)炎癥，而這些因素又與濕性AMD的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。因 此，在開(kāi)發(fā)濕性AMD治療藥物時(shí)，都將VEGF當(dāng)作潛在的治療靶標(biāo)。
[0003] 重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-抗體-人補(bǔ)體受體1融合蛋白（以下簡(jiǎn)稱(chēng)IBI302) 就是根據(jù)以上機(jī)理而設(shè)計(jì)研發(fā)的針對(duì)AMD病癥的大分子藥物。它是申請(qǐng)人自主設(shè)計(jì)的具有 全球知識(shí)產(chǎn)權(quán)的I類(lèi)新藥，其給藥途徑設(shè)計(jì)為玻璃體內(nèi)注射，劑量預(yù)計(jì)為0. 5~2mg/眼。
[0004] 自1982年第一個(gè)重組藥物--人工胰島素上市以來(lái)，應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造的 重組融合蛋白藥物已經(jīng)越來(lái)越多被開(kāi)發(fā)出來(lái)，其中部分已經(jīng)作為常規(guī)藥品被人們所接受。 但是由于該類(lèi)藥物均為分子量較大的多肽或蛋白質(zhì)，其性能很不穩(wěn)定，極易變質(zhì)，而且蛋白 質(zhì)高濃度時(shí)容易發(fā)生自我聚集。這些不利因素使得將這類(lèi)藥物制成穩(wěn)定、安全、有效的制劑 提出了巨大挑戰(zhàn)。
[0005] 重組融合蛋白為生物大分子，其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。在生產(chǎn)及儲(chǔ)存過(guò)程中，表達(dá)的蛋白 分子會(huì)發(fā)生各種物理和化學(xué)變化。物理變化有：吸附、去折疊變性、聚集和沉淀等。化學(xué)變 化有：脫酰胺，異構(gòu)化，氧化等。這些變化可能會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品安全性和有效性產(chǎn)生影響。因 此，建立一個(gè)合適的制劑處方以保障產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性非常重要。
[0006]IBI302是雙靶點(diǎn)特異性融合蛋白，為國(guó)家I類(lèi)新藥。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致其 化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，蛋白容易發(fā)生聚集且電荷異構(gòu)體易于從堿性組分轉(zhuǎn)化為酸性組分。因此， 本領(lǐng)域尚需研發(fā)重組蛋白制劑，保障產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種重組蛋白制劑，可以使融合蛋白在較高濃度下穩(wěn)定保 存，此外，制劑在高溫加速、長(zhǎng)期冷藏和反復(fù)凍融等條件下均能保持其穩(wěn)定性，提高臨床使 用安全性。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種重組融合蛋白液體制劑，所述液體制劑包含：重組融 合蛋白、緩沖鹽、穩(wěn)定劑、表面活性劑和無(wú)菌注射用水，其中，
[0009] 所述重組融合蛋白的濃度為5~45mg/mL;
[0010] 所述緩沖鹽為磷酸鹽、醋酸鹽中的一種或兩種以上的組合，且所述鹽的濃度為 5-25mmol/L，較佳地為 8-22mmol/L ;
[0011] 所述穩(wěn)定劑為氯化鈉、氨基酸、多元醇中的一種或兩種以上的組合，所述氨基酸為 精氨酸、甘氨酸、組氨酸中的一種或兩種以上的組合，所述多元醇為蔗糖、山梨醇、甘露醇中 的一種或兩種以上的組合，且所述氯化鈉的濃度為100-200mmol/L，所述氨基酸的濃度為 50-350mmol/L,所述多元醇的濃度為1重量％~15重量％，以所述液體制劑的總重量計(jì)；
[0012] 所述表面活性劑為聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一種或兩種以上 的組合，且所述表面活性劑的濃度為0. 01重量％~0. 08重量％，以所述液體制劑的總重量 計(jì)；
[0013] 且所述液體制劑的pH為4. 5~7. 5。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述重組融合蛋白為重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-抗體-人 補(bǔ)體受體1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0. : 1或SEQ ID N0. : 3所示。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述穩(wěn)定劑為氨基酸、多元醇中的一種或兩種以上的組合。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述氯化鈉的濃度為120-180mmol/L。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述氨基酸的濃度為70-260mmol/L
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述多元醇的濃度為3重量％~10重量％。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述多元醇的濃度為200-300mmol/L，較佳地，為220~ 270mmol/L〇
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述液體制劑的pH為5. 0-7. 2,較佳地，pH為5. 5-7. 0。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述緩沖鹽為磷酸鹽；
[0022] 所述氨基酸為精氨酸；
[0023] 所述多元醇為蔗糖；
[0024] 所述表面活性劑為聚山梨酯20。
[0025] 本發(fā)明中，所述緩沖鹽為枸櫞酸鈉、磷酸鈉鹽、醋酸鈉中的一種或兩種以上的組 合，所述磷酸鈉鹽為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉兩種的組合。
[0026] 本發(fā)明的第二方面，提供一種試劑盒，所述試劑盒含有第一方面所述的液體制劑， 以及盛裝所述液體制劑的容器。
[0027] 進(jìn)一步地，所述試劑盒中還含有說(shuō)明書(shū)。
[0028] 本發(fā)明的第三方面，提供第一方面所述的液體制劑的用途，用于制備預(yù)防和/或 治療年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物。
[0029] 在另一優(yōu)選例中,所述年齡相關(guān)性黃斑變性為濕性年齡相關(guān)性黃斑變性。
[0030] 本發(fā)明的液體制劑，可使重組融合蛋白保持穩(wěn)定，使得該重組蛋白能穩(wěn)定存在于 處方中，提高產(chǎn)品的質(zhì)量，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期，提高臨床使用安全性。液體制劑具有較佳的 熱穩(wěn)定性，在高溫加速、長(zhǎng)期冷藏和反復(fù)凍融等條件下均能保持穩(wěn)定。
[0031] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入地研究，首次意外研發(fā)出一種重組融合蛋白制 劑，在加速、長(zhǎng)期和凍融等條件下，能保障產(chǎn)品的穩(wěn)定性。本發(fā)明可應(yīng)用的重組融合蛋白 (VEGF抑制劑）還包括其他基因工程技術(shù)獲得的重組融合蛋白（VEGF抑制劑）。在此基礎(chǔ) 上，完成了本發(fā)明。
[0033] 重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-抗體-人補(bǔ)體受體1融合蛋白
[0034] 本發(fā)明優(yōu)選的重組融合蛋白是重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-抗體-人補(bǔ)體受 體 1 融合蛋白（參見(jiàn) US61/629, 932 (PCT/US2012/067489);專(zhuān)利名稱(chēng)：Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereof),氨基酸序列如 SEQ ID NO. : 1所示。
[0035] 本發(fā)明另一優(yōu)選的重組融合蛋白是重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-抗體-人補(bǔ)體 受體1融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0. : 3所示。
[0036] 液體制劑
[0037] 本發(fā)明的重組融合蛋白液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、穩(wěn)定劑、表面活性 劑和無(wú)菌注射用水。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、氯化鈉、表面活性 劑和無(wú)菌注射用水。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、多元醇、表面活性 劑和無(wú)菌注射用水。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、氨基酸、表面活性 劑和無(wú)菌注射用水。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述液體制劑，包含：重組融合蛋白、緩沖鹽、多元醇、氨基酸、表 面活性劑和無(wú)菌注射用水。
[0042] 所述重組融合蛋白的濃度為5~45mg/mL。
[0043] 所述緩沖鹽為磷酸鹽、醋酸鹽中的一種或兩種以上的組合，且所述鹽的濃度為 5-25mmol/L，較佳地為 8-22mmol/L。
[0044] 所述穩(wěn)定劑為氯化鈉、氨基酸、多元醇中的一種或兩種以上的組合。
[0045] 所述氨基酸為精氨酸、甘氨酸、組氨酸中的一種或兩種以上的組合。所述氨基酸的 濃度為 50-350mmol/L，較佳地為 70 ~260mmol/L。
[0046] 所述多元醇為蔗糖、山梨醇、甘露醇中的一種或兩種以上的組合。所述多元醇的濃 度為1重量％~15重量％，較佳地為3重量％~10重量％。
[0047] 所述氯化鈉的濃度為100-200mmol/L。
[0048] 所述表面活性劑為聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一種或兩種以上 的組合。
[0049] 所述表面活性劑的濃度為0. 01重量％~0. 08重量％，較佳地為0. 02重量％~ 0. 06重量％，以所述液體制劑的總重量計(jì)。
[0050] 所述液體制劑的pH為4. 5~7. 5,較佳地為5-7。
[0051] 本發(fā)明的液體制劑或包含液體制劑的試劑盒，可以用于制備預(yù)防和/或治療年齡 相關(guān)性黃斑變性的藥物。重組融合蛋白可以保持穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量高，保質(zhì)期長(zhǎng)，提高臨床使 用安全性。
[0052] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0053] 本發(fā)明的有益之處在于：
[0054] (1)本發(fā)明提供具有較長(zhǎng)保質(zhì)期的新型制劑，可使重組融合蛋白，如重組人血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子受體-抗體-人補(bǔ)體受體1融合蛋白保持穩(wěn)定，制劑在高溫加速、長(zhǎng)期冷藏和反 復(fù)凍融等條件下均能保持其穩(wěn)定性。
[0055] (2)本發(fā)明的液體制劑，可以提高重組融合蛋白制劑的物理化學(xué)穩(wěn)定性，使得該重 組蛋白能穩(wěn)定存在于處方中，提高產(chǎn)品的質(zhì)量，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期，提高臨床使用安全性。
[0056] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0057] 除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之