η = 6，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01。
[0028]圖5Α:不同修飾樣品表面成骨細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后的掃描電鏡(SEM)和熒光顯微鏡(FM)圖片。B:不同修飾樣品表面成骨細(xì)胞培養(yǎng)4天和7天后的細(xì)胞活性，η = 6，**ρ〈0.0l0
[0029]圖6:不同修飾樣品表面金黃色葡萄球菌和成骨細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，成骨細(xì)胞的活/死染色(綠色/紅色)圖片:純鈦(a)、二氧化鈦納米管(13)、(0^/5!1)5鋪膜樣品(c)和(Chi/SH-CecB) 5鋪膜后樣品(d)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為了使本研宄發(fā)明的技術(shù)方案以及優(yōu)點(diǎn)更為的清晰，下面將根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0031 ] 本發(fā)明首先通過(guò)酰胺反應(yīng)得到透明質(zhì)酸鈉的抗菌肽修飾產(chǎn)物透明質(zhì)酸鈉-天蠶肽B。其次，通過(guò)陽(yáng)極氧化法制備二氧化鈦納米管，并利用其裝載適量的抗菌肽CecB (200 μ g)。最后利用層層自組裝技術(shù)在裝載CecB的納米管表面構(gòu)建了具有細(xì)菌響應(yīng)性且具有良好細(xì)胞相容性的(Chi/SH-CecB)5涂層。在構(gòu)建流程中，諸多因素會(huì)影響二氧化鈦納米管的合成以及鈦材表面層狀薄膜的構(gòu)建，例如透明質(zhì)酸鈉修飾時(shí)天蠶肽B的量、電解過(guò)程中電解液/電壓及電解時(shí)間、層層自組裝時(shí)聚陽(yáng)/陰離子的濃度旋涂的轉(zhuǎn)速與時(shí)間等，不同的控制條件將影響到細(xì)菌響應(yīng)性鈦基植入材料的構(gòu)建。本發(fā)明著重對(duì)修飾透明質(zhì)酸鈉時(shí)天蠶肽B的量、層層自組裝過(guò)程中聚陽(yáng)/陰離子的濃度、旋涂采用的轉(zhuǎn)速進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，當(dāng)用5mg天蠶肽B修飾25mg透明質(zhì)酸鈉時(shí)即可得到具有良好細(xì)胞相容性和強(qiáng)抗菌性的透明質(zhì)酸鈉-天蠶肽B產(chǎn)物。當(dāng)旋涂設(shè)置為150rpm(8s)，2500rpm(40s)，殼聚糖和透明質(zhì)酸鈉-天蠶肽B的濃度分別為4mg/mL和0.8mg/mL時(shí)，5個(gè)殼聚糖/透明質(zhì)酸鈉-天蠶肽B即可在載藥納米管表面形成均勻的覆蓋層。
[0032]實(shí)施例1、細(xì)菌(透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌)響應(yīng)性鈦基抗菌植入材料制備
[0033]a.二氧化鈦納米管的制備及藥物裝載:將鈦箔(1mmX 10mm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸餾水各自清洗15分鐘。60°C干燥后，利用鉑箔作為陰極和鈦箔作為陽(yáng)極的電化學(xué)電池，含有0.27M氟化銨的體積比為1:1的水/甘油混合物作為電解溶液，在20V恒定電壓的條件下電解60分鐘。將電解后的鈦箔在450°C條件下煅燒2小時(shí)，得到結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的銳鈦礦型二氧化鈦納米管。最后，利用真空壓力載藥法在每片含納米管樣品中裝載200 μ g的抗菌短肽-天蠶肽B。
[0034]b.透明質(zhì)酸鈉的天蠶肽B接枝:將25mg的透明質(zhì)酸鈉和18mg的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)溶解于25mL的PBS溶液中，調(diào)節(jié)其溶液為pH5.5，在磁力攪拌條件下反應(yīng)30分鐘。再在以上混合物溶液中加入5mg的CecB蛋白質(zhì)，磁力攪拌24小時(shí)。所獲得的產(chǎn)物(SH-CecB)用分子量5000D的透析袋透析3天，并利用冷凍干燥技術(shù)收集。
[0035]c.載藥納米管表面多層膜的構(gòu)建:以0.1% (v/v)的醋酸制備殼聚糖溶液(4mg/mL，回調(diào)pH為5.5)，蒸飽水制備SH-CecB溶液(0.8mg/mL)。將spin-coater (旋涂?jī)x)設(shè)置為150rpm/min (8s)，2500rpm/min (40s)。Chi和SH-CecB交替旋涂5次，最終得到的薄膜系統(tǒng)為(Chi/SH-CecB) 5。
[0036]以上a步驟制備所得的二氧化鈦納米管的掃描電鏡圖為圖1.b，可見(jiàn)本發(fā)明中制備得到的納米管具有均勻的管徑且分布在70nm左右。b步驟制備所得產(chǎn)物(SH-CecB)的紅外和核磁表征圖譜分別為圖2.A和圖2.B，兩個(gè)結(jié)果都證明了在SH糖鏈上成功的接枝了CecBo c步驟制備的鋪膜樣品(TNT-CecB-LBLc)的掃描電鏡圖為圖1.d，從圖中可以發(fā)現(xiàn)鋪膜后納米管被成功的覆蓋，在其表面出現(xiàn)許多均勻的納米尺度高聚物團(tuán)聚顆粒。由此可以證明，本發(fā)明成功構(gòu)建了細(xì)菌(透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌)響應(yīng)性的鈦基抗菌植入材料。
[0037]實(shí)驗(yàn)例1、CecB的釋放及多層膜的降解
[0038]本研宄中，外源性透明質(zhì)酸酶(100 μ g/孔)和金黃色葡萄球菌(2X106個(gè)/孔)被用來(lái)輔助研宄材料表面多層膜是否對(duì)透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌具有響應(yīng)性。首先，為了驗(yàn)證透明質(zhì)酸酶對(duì)藥物釋放的影響，每組(TNT-CecB-LBL和TNT-CecB-LBLc)三個(gè)樣品分別浸泡到PBS和富含透明質(zhì)酸酶的PBS(HAase-PBS)溶液中。不同時(shí)間(1、3、6、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216和240小時(shí))孵育(37°C )后，每組樣品中取70 μ L浸出液用以檢測(cè)CecB的釋放速率，每次液體取出后立即補(bǔ)充相等量的PBS/HAase-PBS溶液。本實(shí)驗(yàn)中CecB的釋放量是利用BCA檢測(cè)試劑盒在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定的，其計(jì)算公式為:CecB(% )=(CecB總釋放量)/ (CecB總載藥量)X 100%。其次，我們還利用FITC標(biāo)記的SH-CecB去制備了多層膜，進(jìn)而驗(yàn)證其在金黃色葡萄球菌存在的條件下是否會(huì)快速被破壞。在此，不同培養(yǎng)時(shí)間(4、6、12和24小時(shí))后FITC標(biāo)記TNT-CecB-LBLc樣品的熒光強(qiáng)度被初步檢測(cè)，并將其與對(duì)照組(細(xì)菌培養(yǎng)基)三個(gè)時(shí)間段的熒光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比分析。
[0039]圖3.A結(jié)果顯示，在透明質(zhì)酸酶存在的條件下CecB得到快速的釋放，在6小時(shí)就出現(xiàn)了藥物爆釋現(xiàn)象，且藥物在72小時(shí)左右就被釋放完全。但沒(méi)有透明質(zhì)酸酶存在時(shí)，藥物呈現(xiàn)緩慢釋放狀態(tài)，緩釋時(shí)間可以延緩到168小時(shí)。圖3.B顯示當(dāng)金黃色葡萄球菌存在時(shí)，TNT-CecB-LBLc樣品表面的熒光會(huì)加速衰減:孵育12小時(shí)后熒光即衰減過(guò)半，當(dāng)延長(zhǎng)到24小時(shí)時(shí)熒光幾乎全部消失。以上結(jié)果說(shuō)明，該發(fā)明中所制備的多層膜對(duì)透明質(zhì)酸酶具有強(qiáng)的響應(yīng)性，它可以加速透明質(zhì)酸酶分泌型細(xì)菌感染時(shí)CecB的釋放速率，從而達(dá)到快速、高效抗菌的目的。
[0040]實(shí)驗(yàn)例2、材料表面金黃色葡萄球菌形態(tài)及活性檢測(cè)
[0041]當(dāng)金黃色葡萄球菌150rpm震蕩孵育10小時(shí)后，以2 X 16個(gè)/孔的密度接種于不同鈦基材料的表面以及TCPS上，37°C條件下培養(yǎng)不同時(shí)間。4小時(shí)培養(yǎng)后，分別利用掃描電鏡(SEM)和共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察了不同材料表面的細(xì)菌形貌和數(shù)量。另外還利用CCK-8技術(shù)檢測(cè)了 4，24和72小時(shí)培養(yǎng)后不同材料表面及各組培養(yǎng)基中的細(xì)菌活性。該檢測(cè)中，為了制備SEM觀察樣品，我們首先利用4 %的多聚甲醛溶液對(duì)細(xì)菌進(jìn)行40分鐘的固定，然后對(duì)其進(jìn)行了梯度脫水(20%，40%，60%，80%和100%，叔丁醇)和噴金處理。為了制備CLSM觀察樣品，細(xì)菌也首先被4%的多聚甲醛溶液固定，然后用Hoechst 33258染料對(duì)細(xì)菌核區(qū)進(jìn)行了染色。為了檢測(cè)不同材料表面的細(xì)菌活性，吸棄舊培養(yǎng)液，加入200 UL新鮮培養(yǎng)基以及20 μ L CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)Ih后在450nm處測(cè)量各組吸光值。為了檢測(cè)不同組培養(yǎng)基中的細(xì)菌活性，首先將200 μ L的舊細(xì)菌培養(yǎng)液被分別收集到一個(gè)新的96孔板的各孔中，然后向每孔中加入20 μ L CCK-8溶液，培養(yǎng)Ih后在450nm處測(cè)量各組吸光值。
[0042]圖4.A中展示出了 4小時(shí)培養(yǎng)后不同材料表面粘附細(xì)菌的SEM和CLSM圖。從圖中我們可以看到在培養(yǎng)前期，TNT-CecB-LBL表面的細(xì)菌數(shù)目最少，但該部分細(xì)菌的形貌趨于正常，這可能是由于SH涂層抗細(xì)菌粘附的特性導(dǎo)致了少量細(xì)菌的粘附。TNT-CecB-LBLc材料表面也表現(xiàn)出了強(qiáng)的抗菌性能，從它的SEM圖中我們發(fā)現(xiàn)大部分的粘附細(xì)菌表現(xiàn)出了畸態(tài)的細(xì)菌形貌，這可能是涂層中暴露的CecB末端賦予了該樣品強(qiáng)的抗菌能力。另外，材料表面(圖4.B)和培養(yǎng)基中(圖4.C)的細(xì)菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了細(xì)菌感染初期(4小時(shí))TNT-CecB-LBL表面會(huì)粘附最少的細(xì)菌，但剩余的細(xì)菌會(huì)在培養(yǎng)基中大量增殖。隨著感染時(shí)間的加長(zhǎng)，TNT-CecB-LBL的抗菌能力會(huì)明顯低于TNT-CecB-LBLc組。由此，結(jié)果表明相較于其它實(shí)驗(yàn)組，TNT-CecB-LBLc樣品具有最強(qiáng)且最長(zhǎng)效的抗菌性能。
[0043]實(shí)驗(yàn)例4、材料表面成骨細(xì)胞形態(tài)及活性檢測(cè)
[0044]當(dāng)成骨細(xì)胞成長(zhǎng)到第三代時(shí)，2X 14個(gè)/孔的密度接種于各鈦片表面以及TCPS上，以I X 16個(gè)/孔的密度接種于不同鈦基材料的表面以及TCPS上，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)不同時(shí)間。48小時(shí)培養(yǎng)后，分別利用掃描電鏡(SEM)和熒光顯微鏡(FM)觀察了不同材料表面的細(xì)胞的形貌。另外還利用CCK-8技術(shù)檢測(cè)了 4天和7天培養(yǎng)后不同材料表面的細(xì)胞活性。該檢測(cè)中，為了制備SEM觀察樣品，我們首先利用4%的多聚甲醛溶液對(duì)材料表面的成骨細(xì)胞進(jìn)行了 40分鐘的固定，然后對(duì)利用梯度脫水