一種脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠及其制備新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織基質(zhì)材料制備，尤其涉及一種脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠及其制備的新方法，屬于生物材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]組織器官的修復(fù)與重建是指組織、器官損傷后由臨近健康細(xì)胞通過再生來修補(bǔ)恢復(fù)的過程，由于組織自發(fā)愈合過程固有的缺陷，一旦組織和器官出現(xiàn)缺損或功能障礙時，就會造成一定程度上的再生障礙或者是永久性缺損。因此組織器官的修復(fù)與重建一直是生物、醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。伴隨著對組織再生修復(fù)機(jī)制及組織工程學(xué)研究的開展和深入，尋找及研制各種有應(yīng)用價值的可吸收并能促進(jìn)再生的生物物質(zhì)，已經(jīng)成為該領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)。
[0003]細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由動物細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，主要成分包括膠原纖維、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖(透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素)等糖類，還有一些脂質(zhì)和生長因子。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動，在細(xì)胞遷移、分化和增殖方面有著重要的作用。由于細(xì)胞外基質(zhì)可以來源于不同的組織器官，因此不同組織器官的脫細(xì)胞基質(zhì)在成分和三維超微結(jié)構(gòu)上也存在差異，研究證實(shí)，源自相同組織器官的細(xì)胞外基質(zhì)在修復(fù)相同組織器官的損傷時效果更好，Wang等比較了人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)和脫細(xì)胞小腸黏膜上皮微粒的體內(nèi)成脂能力，結(jié)果表明人脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)更能有效誘導(dǎo)脂肪組織的形成。
[0004]異種或異體細(xì)胞抗原由于被宿主認(rèn)為是外來體，因此引發(fā)了宿主的炎性反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。然而細(xì)胞外基質(zhì)是結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的復(fù)合物，該組分常常在不同物種間保守，并能被異種受體耐受。許多動物組織器官和人體具有相似的細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)，通過脫細(xì)胞技術(shù)獲得的ECM生物支架已被廣泛應(yīng)用與人體組織重建，如心臟膜瓣、皮膚、肌腱和硬腦膜等，其三維結(jié)構(gòu)與體內(nèi)細(xì)胞生長的天然環(huán)境接近，不僅可以起著支架材料的作用，而且包含多種生長因子，在組織修復(fù)和重建中有重要促進(jìn)作用。
[0005]目前制備細(xì)胞外基質(zhì)的脫細(xì)胞方法有很多，主要包括物理法、化學(xué)法和生物處理法，但是每種脫細(xì)胞方法均會改變ECM成分，引起不同程度超微結(jié)構(gòu)的損害，這些改變會影響人體對植入基質(zhì)材料的反應(yīng)。因此研究通過溫和的脫細(xì)胞方法得到細(xì)胞外基質(zhì)，最大限度的保留組織ECM的成分和天然結(jié)構(gòu)，是非常有必要的。
[0006]目前國內(nèi)外研究大多是將細(xì)胞外基質(zhì)用于組織工程支架，通過植入人體代替受損組織器官，為組織器官細(xì)胞再生提供支架，并隨著自體組織的修復(fù)逐漸降解吸收。然而這種傳統(tǒng)的細(xì)胞外基質(zhì)支架對于損傷較小、受損區(qū)域不規(guī)則或無需替代的受損組織則不適用，因此國內(nèi)外學(xué)者已開始嘗試改變脫細(xì)胞基質(zhì)的使用形態(tài)以滿足多種組織或器官修復(fù)的需要，申請?zhí)枮?00910191251.1的專利公開了一種用于組織修復(fù)的顆粒狀生物材料及制備方法，通過將脫細(xì)胞基質(zhì)和膠原、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、殼聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、藻酸鹽中任一種或至少兩種組合而制備的膜片狀生物材料凍干，再在設(shè)定參數(shù)下常溫切割成長條，最后切割成粒徑范圍在60 μ m-6000 μ m的顆粒狀，采用注射、噴灑、播撒、填塞方法直接用于組織或器官修復(fù)，但是顆粒狀材料黏附性差，粒徑不均造成吸收不平衡，修復(fù)效果不理想；申請?zhí)枮?00980135089.X的專利公開了一種制造脫細(xì)胞基質(zhì)膠的方法，通過將脫細(xì)胞基質(zhì)加入水、生理緩沖液或鹽水中在70?100°C下溫育10分鐘至48小時，形成脫細(xì)胞基質(zhì)膠，用于制備包括組織工程和疝修復(fù)在內(nèi)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用的強(qiáng)化脫細(xì)胞基質(zhì)，但是該方法由于溫育溫度高，使得脫細(xì)胞基質(zhì)的活性成分如生長因子等被嚴(yán)重破壞，使用效果大大降低。
[0007]理想的組織器官修復(fù)材料應(yīng)盡可能模擬人體組織所處的生理環(huán)境，為組織再生提供細(xì)胞生長空間，能夠誘導(dǎo)組織細(xì)胞再生分化，促進(jìn)損傷組織的再生修復(fù)，并且能滿足不同部位不規(guī)則形狀的修復(fù)需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)材料的局限性，提供了一種脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠及其制備方法，通過脫細(xì)胞處理和凝膠化處理，將取自哺乳動物的組織器官制備成脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠，消除了異種(體)組織的免疫原性，最大限度的保留了組織細(xì)胞外基質(zhì)成分的活性，能夠特異性修復(fù)人體受損組織器官，誘導(dǎo)組織再生，并且適用性強(qiáng)，能滿足不同組織各種不規(guī)則形狀修復(fù)區(qū)域的需要。
[0009]本發(fā)明制備脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠的策略為:首先對動物組織器官進(jìn)行預(yù)處理，清除血跡和污垢，經(jīng)病毒滅活后剪成碎塊，以利于細(xì)胞脫除，然后用去垢劑除去細(xì)胞膜脂質(zhì)成分，增加細(xì)胞的通透性，再用胰蛋白酶處理，脫除細(xì)胞，再經(jīng)核酸酶降解細(xì)胞中各類DNA和RNA成分，經(jīng)清洗除掉各種去垢劑后得到脫細(xì)胞基質(zhì)，脫細(xì)胞基質(zhì)再經(jīng)消化和恒溫孵育得到脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠。
[0010]進(jìn)一步的，本發(fā)明制備脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠的具體步驟如下:
[0011]I)預(yù)處理:用PBS緩沖液清洗除去新鮮動物組織器官上的血跡和污垢；
[0012]2)病毒滅活:將前一步驟預(yù)處理后的動物組織器官用病毒滅活試劑浸泡進(jìn)行病毒滅活，所述病毒滅活試劑為過氧乙酸水溶液；
[0013]3)剪碎:將前一步驟病毒滅活處理后的動物組織器官剪碎；
[0014]4)脫除細(xì)胞膜脂質(zhì)成分:用含去垢劑的PBS緩沖溶液脫除細(xì)胞膜脂質(zhì)成分，脫除處理后采用PBS緩沖液清洗；
[0015]5)脫細(xì)胞:用含胰蛋白酶和EDTA的PBS緩沖溶液脫除細(xì)胞，脫除處理后采用PBS緩沖液清洗；
[0016]6)核酸酶處理:用含核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的PBS混合溶液脫除殘留的細(xì)胞核成分，酶脫除反應(yīng)結(jié)束后采用PBS緩沖液清洗，得到組織脫細(xì)胞基質(zhì)；
[0017]7)消化:將前一步驟的組織脫細(xì)胞基質(zhì)置于消化液中振蕩進(jìn)行消化處理，所述消化液為蛋白酶溶液；
[0018]8)恒溫孵育:消化反應(yīng)結(jié)束后加入PBS緩沖液進(jìn)行恒溫孵育，即可得到脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠。
[0019]本發(fā)明所提供的由細(xì)胞外基質(zhì)制備凝膠的方法簡單，條件溫和，對細(xì)胞外基質(zhì)中的營養(yǎng)因子和生長因子破壞小，修復(fù)效果好；同時本發(fā)明還提供了一種溫和的組織脫細(xì)胞方法，能夠快速有效的脫除細(xì)胞，并且最大限度的保留細(xì)胞外基質(zhì)成分的活性。
[0020]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn):
[0021]進(jìn)一步的，步驟I)所述動物組織器官來源于哺乳動物的組織器官。
[0022]所述哺乳動物選自人、豬、牛、羊和兔；所述組織器官選自皮膚、腦膜、膈膜、羊膜、心包膜、心臟瓣膜、小腸粘膜下層、肌肉、血管、肌腱、韌帶、軟骨、食道、胃、神經(jīng)和膀胱。
[0023]進(jìn)一步，步驟2)所述病毒滅活試劑為質(zhì)量濃度0.1%?1%的過氧乙酸水溶液。
[0024]進(jìn)一步，步驟2)所述病毒滅活試劑浸泡的時間為0.5?2h。
[0025]進(jìn)一步，步驟3)動物組織器官剪碎后獲得的碎片或碎塊的粒徑范圍為0.1?1cm。
[0026]進(jìn)一步，步驟4)所述的含去垢劑的PBS緩沖溶液，去垢劑的濃度為0.1?2wt% ；去垢劑的種類選自曲拉通X-100、脫氧膽酸鈉、平平加，以及十二烷基磺酸鈉中的任一種。
[0027]更進(jìn)一步，步驟4)所述細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的脫除方法為:室溫下振蕩處理0.5?2h。
[0028]進(jìn)一步，步驟5)所述的含胰蛋白酶和EDTA的PBS緩沖溶液，胰蛋白酶的濃度為0.1 ?lwt%，EDTA 的濃度為 0.1 ?lwt%。
[0029]更進(jìn)一步，步驟5)所述脫除細(xì)胞處理的條件為:室溫振蕩處理I?4h。
[0030]進(jìn)一步，步驟6)所述的含核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的PBS混合溶液，核糖核酸酶的濃度為5?50 μ g/ml,脫氧核糖核酸酶的濃度為50?500 μ g/ml。
[0031]更進(jìn)一步，步驟6)所述脫除細(xì)胞核成分處理的反應(yīng)條件為室溫振蕩l_2h。
[0032]進(jìn)一步,步驟7)所述消化液為0.1?0.5wt%的蛋白酶溶液,所述蛋白酶的種類選自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，以及組織蛋白酶中的任一種。
[0033]消化液的pH值為上述蛋白酶的最適pH值，可通過市售商品酶的說明書獲知。通過調(diào)節(jié)PH的方法終止消化反應(yīng)，之后將pH值調(diào)至人體體液pH值(pH值7.35?7.45)，再進(jìn)行后續(xù)孵育步驟。
[0034]更進(jìn)一步，步驟7)消化處理的時間為24?48h。
[0035]進(jìn)一步，步驟8)所述恒溫孵育的時間為24?48h，孵育溫度為37±1°C。
[0036]本發(fā)明第二方面公開了一種脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠，采用上述方法制備獲得。
[0037]本發(fā)明提供的脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠由哺乳動物的組織器官經(jīng)脫細(xì)胞和凝膠化處理得到，用于人體受損組織器官的特異性修復(fù)。
[0038]本發(fā)明第三方面公開了前述脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠的制備方法，以及脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠在特異性修復(fù)人體受損組織器官中的應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明所述特異性修復(fù)，指用源自相同組織器官的脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠修復(fù)相同的受損組織。
[0040]本發(fā)明第四方面公開了前述脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠的制備方法，以及脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠在制備組織損傷修復(fù)制劑中的應(yīng)用。
[0041]本發(fā)明的有益效果如下:
[0042]1.本發(fā)明提供的脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)凝膠及其制備方法最大限度的