Zmym1在制備帕金森診療試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及ZMYMl在制備帕金森診療試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森病（Parkinson's disease，PD)是一種慢性進(jìn)展性疾病，目前無(wú)法治愈，它 于1817年被英國(guó)人Parkinson首先描述，隨著對(duì)的研宄進(jìn)展，我們對(duì)這個(gè)疾病也有了更 深的了解，它在臨床上表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)性癥狀如靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙 及非運(yùn)動(dòng)性癥狀如便秘、睡眠障礙、精神行為異常等。目前ro的發(fā)病機(jī)制還不清楚，可能與 遺傳因素、線粒體功能缺陷、氧化應(yīng)激、免疫異常、細(xì)胞凋亡、環(huán)境因素等有關(guān)。在ro中，約 10 %的患者為家族型ro患者，具有明顯的遺傳特性，剩下的90 %為散發(fā)性ro患者?，F(xiàn)在許 多研宄認(rèn)為，ro是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，而對(duì)ro致病基因的研宄是目前對(duì) H)發(fā)病機(jī)制研宄的一大熱點(diǎn)。迄今為止，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)與遺傳性H)相關(guān)的基因有SNCA，LRRK2， DJ-l，PINK-l，Parkin等，這些致病基因還需進(jìn)一步研宄，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需求。對(duì) 于ro患者，提前發(fā)現(xiàn)提前制定有針對(duì)性的個(gè)性化治療方案及最適合患者的療法，從而改善 左旋多巴類(lèi)藥物的治療狀況和最大限度提高患者的生存質(zhì)量，減輕患者的痛苦、減少家庭 和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這就需要提供更多的分子標(biāo)記以便能及早診斷出帕金森病。
[0003] 為解決目前帕金森分子標(biāo)記物稀缺的問(wèn)題，發(fā)明人對(duì)15例帕金森患者外周血樣 本及9例健康人對(duì)照外周血樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑 選出候選基因 zmyml。進(jìn)一步，本發(fā)明進(jìn)行了分子細(xì)胞生物學(xué)方法證實(shí)了 zmyml與帕金森病 的關(guān)系與帕金森病具有很好的相關(guān)性，可用于制備帕金森輔助診療制劑，具有重要 的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供ZMYMl基因和/或蛋白在制備帕金森治療制劑中的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因 ZMYM1，進(jìn)一步通過(guò)分子細(xì)胞生物學(xué)方法驗(yàn)證了 ZMYMl與帕金森的關(guān)系：ZMYMl與帕金森 具有很好的相關(guān)性，可用于制備治療帕金森制劑和/或帕金森診斷制劑，具有重要的臨床 應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 進(jìn)一步，所述帕金森治療制劑是指可以促進(jìn)ZMYMl基因的表達(dá)的制劑。本領(lǐng)域人 員熟知促進(jìn)基因的表達(dá)通常可以采用下述方法中的一種和/或幾種：通過(guò)DNA水平調(diào)控 ZMYMl基因：包括但不限于增加 ZMYMl基因的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)染含ZMYMl基因的過(guò)表達(dá)載體；通 過(guò)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ZMYMl基因：包括但不限于激活ZMYMl基因的表達(dá)、激活調(diào)控ZMYMl基因 表達(dá)的啟動(dòng)子、抑制負(fù)調(diào)控ZMYMl基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、采用RNA干擾技術(shù)對(duì)抑制ZMYMl基 因表達(dá)的抑制子進(jìn)行干擾；通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控ZMYMl基因：包括但不限于抑制促進(jìn)ZMYMl 基因 mRNA降解的microRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)、導(dǎo)入促進(jìn)ZMYMl基因表達(dá)的microRNA ;通過(guò)翻譯后水 平調(diào)控ZMYMl基因：包括但不限于導(dǎo)入促進(jìn)ZMYMl基因編碼蛋白的分子、抑制負(fù)調(diào)控ZMYMl 基因表達(dá)的蛋白、促進(jìn)ZMYMl基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0007] RNA干擾（RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA 設(shè)計(jì)完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，制備好的SiRNA可以通過(guò)磷酸 媽共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽(yáng)離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療帕金森制劑，所述抗帕金森制劑促進(jìn)帕金森患者 中ZMYMl基因的表達(dá)。進(jìn)一步，所述的治療帕金森制劑中含有促進(jìn)ZMYMl基因表達(dá)的載體。
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供ZMYMl基因和/或蛋白在制備帕金森診斷制劑中的應(yīng)用。
[0010] 進(jìn)一步，所述的帕金森的診斷制劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片方法檢測(cè) 帕金森外周血中ZMYMl基因的表達(dá)。
[0011] 熒光定量PCR法是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過(guò)程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定 量。多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0012] 基因芯片又稱(chēng)為DNA微陣列（DNA microarray)，可分為三種主要類(lèi)型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的靶基因與其雜交，通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過(guò)與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷 酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。基因芯片作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡(jiǎn)便；三是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0013] 所述的用于熒光定量PCR方法檢測(cè)帕金森中ZMYMl基因的產(chǎn)品含有一對(duì)特異性擴(kuò) 增ZMYMl基因的引物；所述的基因芯片包括與ZMYMl基因的核酸序列雜交的探針。
[0014] 進(jìn)一步，所述的帕金森的診斷制劑包括用免疫方法檢測(cè)ZMYMl蛋白的表達(dá)。優(yōu)選 所述免疫檢測(cè)方法檢測(cè)帕金森中ZMYMl蛋白表達(dá)的為western blot和/或ELISA和/膠 體金檢測(cè)方法。
[0015] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過(guò)氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0016] 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或外周血 切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo) 記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2) 免疫膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或外周血超薄切 片結(jié)合，然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微 孔濾膜作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體 檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜 上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的 樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng) 至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截 留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十 分方便。
[0017] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)ZMYMl蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒 中的抗體可采用市售的ZMYMl單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被ZMYMl單克隆 抗體的固相載體，酶標(biāo)二抗，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終 止液等。
[0018] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)ZMYMl蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采用 市售的ZMYMl單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或 膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)（T)噴點(diǎn)有抗 ZMYMl單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)帕金森的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒檢測(cè)基因 ZMYM1，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 1， 下游引物序列為SEQ ID NO. 2。
[0020] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型熒光定量基因擴(kuò)增儀， 靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0021] 進(jìn)一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量PCR 反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 1， 下游引物序列為SEQ ID N0.2。所述內(nèi)參引物為β-actin內(nèi)參引物，上游引物序列為SEQ ID NO. 3,下游引物序列為SEQ ID NO. 4。
[0022] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。優(yōu)選TRlzol? Reagent進(jìn)行樣本RNA提取。
[0023] 本發(fā)明還檢測(cè)了本試劑盒靈敏性，結(jié)果顯示本試劑盒檢測(cè)范圍為106-10 2C〇pieS/ μ 1，最小檢出濃度為IOOcopies/ μ 1。
[0024] 本發(fā)明目的是提供了