無顯著差異，說明羥乙基殼聚糖原位水凝膠屬 于無毒的生物材料；
[0023] (2)、皮內刺激試驗：根據(jù)國標醫(yī)療器械生物學評價一刺激與遲發(fā)型超敏反應試驗 (GB/T 16886. 10-2005)標準，進行羥乙基殼聚糖原位水凝膠浸提液的皮內反應試驗，通過 皮內注射材料浸提液，對材料產生刺激反應的潛在性做出評價；挑選皮膚健康無損傷、初成 年的新西蘭大白兔，雌雄不限，體重不低于2kg，按GB/T 16886. 2的規(guī)定飼養(yǎng)，使動物適應 環(huán)境，試驗前徹底除去動物背部脊柱兩側背毛，以備注射浸提液，為了證實試驗的敏感性， 每只動物設有空白對照組；在每只兔脊柱一側的3個點，皮內注射0. 2ml用生理鹽水制備的 羥乙基殼聚糖原位水凝膠浸提液（浸提標準同上），同時在每只兔脊柱另一側的五個皮內 注射點上注射〇. 2ml生理鹽水作為對照組，注射后0h、24h，48h，和72h分別觀察記錄各注 射部位狀況，按表1給出的記分系統(tǒng)對每一觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應評 分，并記錄試驗結果；
[0027] (3)、體內降解性實驗：將羥乙基殼聚糖原位水凝膠注入小鼠腿部肌肉后，實驗組 小鼠全部成活，無感染及其他并發(fā)癥發(fā)生，腿部均無腫脹現(xiàn)象，定期切開注射部位觀察，均 未發(fā)現(xiàn)充血、化膿等現(xiàn)象，組織切片鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：Iw時肌肉組織內中有大量的未降解材 料分散于肌肉組織間，并伴有炎癥細胞的浸潤，但材料周圍未見有包膜形成，之后，隨著時 間的推移，材料逐漸降解，炎癥反應也逐漸消退，4w時材料基本降解完全，且炎癥反應完全 消退；
[0028] (4)、生物相容性評價：隨機選取實驗級健康小鼠，雌雄兼半，體重為20g~22g， 20只，選擇小鼠左腿肌肉為注射點，分別注射內毒素檢驗合格的羥乙基殼聚糖原位水凝膠， 100 μ 1/只肌肉注射；分別于l、2、3、4w時將動物處死，每組每次至少3只，首先切開肌肉注 射部位，觀察組織外觀形態(tài)以及材料的降解情況，后取部分肌肉、肝臟及腎臟組織切片，常 規(guī)HE染色，評價其生物相容性及安全性。
[0029] 本實施例制備的羥乙基殼聚糖原位水凝膠移植角膜緣干細胞對角膜損傷修復效 果的評價包括體外培養(yǎng)兔角膜緣干細胞、動物模型建立及實驗分組和術后護理及觀察三個 步驟：
[0030] (1)、體外培養(yǎng)兔角膜緣干細胞：無菌摘取1月齡新西蘭白兔眼球，沿角膜緣環(huán)形 剪開球結膜和結膜下筋膜組織，環(huán)形剪取角膜緣外1_、角膜緣及角膜緣內Imm的角膜緣組 織（深約150um)，消化組織塊后，貼于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，置C02培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)，每天于 倒置顯微鏡下觀察細胞迀移情況，細胞融合成良好的單層（圖2-a);細胞至80%融合時傳 代培養(yǎng)，傳代篩選活性強的細胞（圖2-b)，細胞免疫化學染色檢測Λ Np63(圖2-c)及角蛋 白K3(圖2-d)的表達；當Λ Np63的陽性率高于80%，角蛋白K3/K12的陽性率低于20% 時，可用于后續(xù)的實驗研宄；
[0031] (2)、動物模型建立及實驗分組：新西蘭大白兔，體質量2-3kg，全麻，右眼為術眼， 制作角膜中央部中度堿燒傷模型，左眼為正常對照，將直徑8mm的濾紙片浸入Imol/LNaOH 溶液中，Imin后取出，貼附于角膜中央，與角膜密切接觸Imin后取下，立即用生理鹽水沖洗 角膜表面和結膜囊lmin，形成角膜中央邊界清楚的圓盤狀白色燒傷區(qū)，再用手術刀背輕輕 刮擦眼表，模擬損傷后的摩擦性損傷，使損傷深度達角膜基質層，瞳孔及虹膜窺視不清，依 據(jù)Hughes分度法確認為III度堿燒傷模型建立；動物隨機分為6組，每組20只，3組實驗組 分別為羥乙基殼聚糖原位水凝膠-角膜緣干細胞組、單純羥乙基殼聚糖原位水凝膠和角膜 緣干細胞組，羊膜修復組和術后單純滴加表皮生長因子陽性對照組，不做修復的陰性對照 組；
[0032] (3)、術后護理及觀察：術后，每天用氧氟沙星滴眼液抗感染，1、3、7(1;2,3,4?肉眼 觀察角膜燒傷面積的變化，照相、統(tǒng)計愈合率，同時分別取帶Imm鞏膜組織的角膜片（每組 3眼），固定，均切成四部分，分別做病理、電鏡、免疫組化觀察以及堿燒傷區(qū)組織mRNA和蛋 白的提取，用于修復機理的分析；組織塊法體外培養(yǎng)模型動物的角膜緣干細胞；建立中重 度堿燒傷的動物模型；將體外培養(yǎng)的角膜緣干細胞與CMCTS混合后，與氧化海藻酸鈉經(jīng)過 雙聯(lián)注射器交聯(lián)混合至損傷眼表，同時設置只加羥乙基殼聚糖原位水凝膠和角膜緣干細胞 修復組、羊膜或表皮生長因子陽性對照組，不進行任何修復措施的陰性對照組，術后通過損 傷區(qū)域、病理切片以及掃描電鏡觀察評價修復效果；術畢，各組均縫合上下眼瞼；術后定期 觀察外眼像，觀察二者聯(lián)合對角膜損傷的修復作用，結果發(fā)現(xiàn)，對照組15d時仍未修復，中 間受損區(qū)明顯呈白色的瘢痕狀，且新生血管較多，而實驗組角膜基本呈透明狀，說明羥乙基 殼聚糖原位水凝膠聯(lián)合角膜緣干細胞對角膜堿燒傷有良好的修復作用。
[0033] 本實施例制備的羥乙基殼聚糖原位水凝膠移植角膜緣干細胞對角膜損傷修復的 機理推導過程為：以新西蘭大白兔為實驗對象，設置羥乙基殼聚糖原位水凝膠聯(lián)合角膜緣 干細胞治療組和不作治療處理的對照組，每組15只；定期提取正常角膜組織、損傷修復組 和模型對照組的mRNA及蛋白，檢測轉化生長因子-β通路相關因子，從轉錄和蛋白水平 分析羥乙基殼聚糖原位水凝膠-角膜緣干細胞的作用機理；mRNA逆轉錄成cDNA后進行 real-time PCR檢測轉化生長因子-|3 1、smad2、smad3以及去磷酸化酶PPMlA(如圖3, Α)， 結果發(fā)現(xiàn)：將正常角膜的表達量定為"1"，模型對照組的PPMlA表達量為1.6,轉化生長因 子-β為16. 9;而修復組PPMlA顯著升高至8. 4,轉化生長因子-β顯著降低至5. 7;而兩 組的smad2、smad3基本沒有變化；western blot檢測轉化生長因子-β、smad2、smad3以 及磷酸化smad2 (p-smad2)、p-smad3、PPMlA的蛋白量（如圖3, B-D)，結果同樣顯示：修復 組PPMlA高于模型對照組，而轉化生長因子-β正好相反；而兩組的smad2、smad3總蛋白 量沒有明顯變化，但二者的磷酸化水平均降低；角膜損傷后，轉化生長因子-β明顯上調， 誘導角膜基質細胞向肌成纖維細胞轉化，導致纖維化瘢痕的形成，嚴重影響角膜的透明性； TGF-β是角膜損傷修復的關鍵因子；Smad寡聚物進入核內后，可受到多種蛋白的調節(jié)，其 中鎂依賴蛋白磷酸酶IA(PPMlA)是Smad寡聚物的一種重要調節(jié)分子，屬于PPM家族成員； PPMlA是一種金屬離子依賴型的蛋白磷酸酶，剪切底物為絲氨酸和蘇氨酸殘基上的磷酸基 團，使Smad2/3去磷酸化，抑制轉化生長因子-β /Smad信號通路，通過PPMlA敲除小鼠的眼 表損傷發(fā)現(xiàn)，PPMlA的缺失可導致磷酸化Smad2/3明顯上調，轉化生長因子-β通路激活， 導致眼表損傷修復過程延遲，所以PPMlA是轉化生長因子-β /Smad信號通路的重要負調控 因子，對于眼表損傷修復具有重要作用。
[0034] 本實施例涉及的羥乙基殼聚糖原位水凝膠移植角膜緣干細胞對角膜嚴重損傷進 行修復的機理為：通過作用PPMlA的轉錄水平促進其蛋白表達，從而降低smad2、smad3的磷 酸化水平，抑制轉化生長因子-β /Smad通路，促進眼表損傷修復。
【主權項】
1. 一種羥乙基殼聚糖原位水凝膠的制備方法，其特征在于制備工藝包括高碘酸鈉水溶 液制備、氧化海藻酸鈉制備和羥乙基殼聚糖原位水凝膠制備三個步驟： (1) 、高碘酸鈉水溶液制備：常溫下稱取高碘酸鈉粉末Ig并溶于50ml去離子水中，制得 質量百分比濃度為2%的高碘酸鈉水溶液； (2) 、氧化海藻酸鈉制備：在質量百分比濃度為2%的海藻酸鈉水溶液中按海藻酸鈉與 高碘酸鈉反應的摩爾比為10:1加入步驟（1)制備的高碘酸鈉水溶液，在室溫下攪拌海藻酸 鈉水溶液和高碘酸鈉水溶液混合形成的混合液使其進行氧化反應，24h后在混合液中加入 乙二醇IOOul終止氧化反應0. 5h，抽濾混合液并用無水乙醇脫水沉淀得到白色固形物，低 溫真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸鈉粗品，再將氧化海藻酸鈉粗品用蒸餾水溶解成 質量百分比濃度為2%的氧化海藻酸鈉粗品水溶液，在4°C溫度下將氧化海藻酸鈉粗品水 溶液置于透析袋中透析，每6h換1次蒸餾水，用電導率儀測定氧化海藻酸鈉粗品水溶液透 析完全后進行離心后取上清液冷凍干燥制得氧化度為10 %的氧化海藻酸鈉； (3) 、羥乙基殼聚糖原位水凝膠制備：將質量百分比濃度為2%羥乙基殼聚糖與步驟 (2)制得的氧化海藻酸鈉按質量比8:1等體積混合后經(jīng)過雙聯(lián)注射器交聯(lián)反應擠推至試管 中得羥乙基殼聚糖原位水凝膠。2. 根據(jù)權利要求1所述的羥乙基殼聚糖原位水凝膠的制備方法，其特征在于所述高碘 酸鈉為強氧化劑，能氧化鄰二醇結構，使其成為醛或酮；海藻酸鈉的糖醛酸單元具有順式鄰 二醇結構，能在高碘酸鈉的氧化作用下打開C-C鍵生成兩個醛基，海藻酸鈉通過氧化引入 醛基制備得到的氧化海藻酸鈉，直接與帶有游離氨基的羥乙基殼聚糖發(fā)生交聯(lián)反應在創(chuàng)面 快速形成原位水凝膠，作為角膜緣干細胞移植載體，促進角膜上皮重建。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，具體涉及一種羥乙基殼聚糖原位水凝膠的制備方法，首先將高碘酸鈉粉末溶于去離子水中，制得高碘酸鈉水溶液，然后攪拌海藻酸鈉水溶液與高碘酸鈉水溶液形成混合液使其進行氧化反應后加入乙二醇終止反應，抽濾混合液并用無水乙醇脫水沉淀后低溫真空干燥制得氧化海藻酸鈉粗品，再用蒸餾水溶解成氧化海藻酸鈉粗品水溶液，將其透析完全后進行離心取上清液冷凍干燥制得氧化海藻酸鈉，最后將羥乙基殼聚糖與氧化海藻酸鈉混合經(jīng)雙聯(lián)注射器交聯(lián)反應擠推至試管中得羥乙基殼聚糖原位水凝膠，用于角膜緣干細胞的快速包封移植；其制備工藝簡單，原理安全可靠，制備成本低，產品質量好，使用安全，衛(wèi)生，治療環(huán)境友好。
【IPC分類】A61L27/48, A61L27/52, A61L27/50
【公開號】CN104984402
【申請?zhí)枴緾N201510413137
【發(fā)明人】徐文華, 梁曄, 管洪在, 常志尚, 王元松
【申請人】青島大學
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月14日