10%福爾馬林并且包埋于石蠟塊中。組織學切片在熒光顯微鏡中以IOOX和 400Χ檢查。ClotBlock的消除由樣品中完全不存在熒光蹤跡或通過2周和4周時觀察到的 熒光水平來確定。
[0130] 結(jié)果：在應用4周內(nèi)在所有器官中消除了 Clotblock(圖8)。
[0131] 4. 5.評估免疫應答
[0132] 評估對ClotBlock的潛在抗體應答。
[0133] 方法：從經(jīng)受IV級肝損傷（4. 3)的實驗動物收集血清樣品，收集于術(shù)后的處理前 與處理后的0天、7天和21天，并且冷凍貯存在-20°c直至分析。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)檢測對用于ClotBlock的配制的組分所生成的抗體。
[0134] 為了檢測在豬中可能產(chǎn)生的針對ClotBlock的組分的抗體，構(gòu)建了夾心ELISA (酶 聯(lián)免疫吸附測定）。96孔微量滴定板的底面在4°C下用纖維蛋白（在PBS中10mg/ml，pH值 7.0, Sigma-Aldrich 公司）或凝血酶（在 PBS 中 nlOmg/ml 中 PBS，pH 值 7.0, Sigma-Aldrich 公司）包被過夜。用PBS對所有孔洗滌5次。豬血清的樣品用PBS以I :20的最終稀釋度 應用，在室溫下孵育1小時，并且用PBS洗滌5次。酶（辣根過氧化物酶）連接的兔抗豬 IgG抗體（Sigma-Aldrich公司）用PBS以1 :20稀釋應用于所有孔，在室溫下孵育1小時， 并且用PBS洗滌5次。通過將基質(zhì)（2, 2' -連氮基-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨 鹽，IOmg/膠囊，Sigma-Aldrich公司）的一個膠囊溶解于100mL磷酸鹽-梓檬酸鹽緩沖液 (pH 5.0)以及添加 H2O2(0.25ml的3%溶液）制備基質(zhì)。接著，在室溫下孵育10分鐘，使用 BioTek的EX800酶標儀確定405nm的光密度。
[0135] 每個目標組分用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS (pH 7.4)以1:100稀釋，包被于微量滴定板 孔中，并且在4°C下孵育過夜。這些孔用PBS(封閉緩沖液）中的0.25% (wt/vol)脫脂奶 粉/0. 2% Tween 20封閉，然后用封閉緩沖液中的1:10稀釋的動物血清50yL在37°C下孵 育1小時。結(jié)合的IgG和IgM作為二次抗體的標準ELISA系統(tǒng)進行檢測。
[0136] 用5份正常動物血清來確定正常范圍。升高的抗體水平被定義為大于正常平均值 以上的兩個標準偏差。每個板包括用除了稀釋血清的所有試劑孵育的孔，該孔提供了從所 有結(jié)果中減去的背景吸收。純化的凝血酶的抗體由描述為凝血酶原的抗體的確定，除了純 化的凝血酶（5 μ g/mL)用于包被微孔滴定板。抑制性抗凝血因子（anti-factor) V抗體結(jié) 合于因子V C2結(jié)構(gòu)域，這與出血臨床表象相關。人凝血因子（human factor) V抗體通過用 鼠單克隆抗凝血因子V抗體6A5 (50 μ L 2. 5 μ g/mL，4°C整夜）包被微量滴定板孔識別。洗 滌和封閉各孔，之后，將用50 yL 5 μ g/mL人凝血因子V孵育各孔。用1:10稀釋的動物血 漿在37°C下孵育各孔1小時。如上所述地檢測結(jié)合的IgG(標準夾心ELISA)。
[0137] 非常重要的是要考慮到，然后提出的是在大鼠和豬中測試的對于人體成分的跨物 種模型產(chǎn)酶系統(tǒng)。即使動物產(chǎn)生針對任何ClotBlock組分的抗體，這仍不能肯定結(jié)果可以 外推至人類。在臨床前階段沒有同源實驗系統(tǒng)。
[0138] 統(tǒng)計分析
[0139] 將使用Kruskal I-Wal I is測試執(zhí)行兩個治療武器內(nèi)的6個隨機小組之間定量變量 的比較。Mann-Whitney U測試將用于評價每個隨機組之間的差異。統(tǒng)計分析采用Stata， 9. 0版本（Stata，學院站，TX)進行，P〈0. 05認為有統(tǒng)計學顯著差異。
[0140] 結(jié)果與結(jié)論：當針對纖維蛋白或凝血酶測試時，從對照和ClotBlock處理的豬在 第0天、第7天或第21天收集的血清未觀察到OD讀數(shù)的顯著差異（圖9和10)。我們的結(jié) 論是實驗豬未產(chǎn)生可檢測的抗ClotBlock抗體。
[0141] 5.滅菌
[0142] 對clotcake的無菌制備進行研究。
[0143] 使用Nalg-Nunc公司500mL裝置（目錄#450-0045,硝化纖維素膜，0· 45m的過濾 器）在生物安全柜中無菌過濾酸性纖維蛋白單體。
[0144] 生長研究：一般實驗方案包括制備樣品溶液，隨后在培養(yǎng)皿中的馬鈴薯葡萄糖瓊 脂（PDA，Sigma-Aldrich公司，目錄號P2182)和胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA，Sigma-Aldrich公 司，目錄號T4536)凝膠上涂樣品溶液以用于生長。在菌落生長（模具和/或細菌）的指示 時間周期孵育并觀察PDA和TSA凝膠。
[0145] 樣品在37°C下孵育30分鐘，并且用肉眼在結(jié)果和討論部分所指示的時間周期評 估菌落生長。該樣品以二分裂或三分裂形式生長，在數(shù)據(jù)表中用1、2和3指示標示多個樣 本。用于評估的評分如下：
[0146] 表2.菌落計數(shù)鍵
[0147]
[0148] 表3示出FIBRIN_ClotFoam的無菌組分的PDA和TSA上的微生物生長分析的研究 的結(jié)果。
[0150] **無菌C用于SUNY中的動物研究，在4°C下存儲一周
[0151] 增長數(shù)據(jù)表明，無菌組分即使在11天后也沒有產(chǎn)生顯著的生長。此外，下列技術(shù) 可以用于滅菌。
[0152] 6.生物相容性
[0153] 兩個ClottBlock制劑在無菌條件下制備和測試。用人成纖維細胞（HF)和人上皮 細胞（A549細胞系，ATCC)測試這些制劑的生物相容性。
[0154] 正常人成纖維細胞（HF)由商業(yè)購買得到并且在60mm組織培養(yǎng)平板中以Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基（補充有10%胎牛血清）構(gòu)建培養(yǎng)物，并且在潮濕的5% CO2氣氛（CO2培養(yǎng)箱）中保持在37°C。人上皮細胞系A549保持在補充有10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺 的最低必需培養(yǎng)基中。當成纖維細胞和上皮細胞的培養(yǎng)物達到亞融合時，對照和苯甲酸鈉 ClotFoam制劑混合，并且立即傳遞到單獨的皿器。將培養(yǎng)物返回到CO2培養(yǎng)箱并且每日檢 查共五天。ClotFoam材料和介質(zhì)從所有培養(yǎng)物中除去，并且貼壁細胞用結(jié)晶紫（0.1%，在 2%乙醇中）染色。
[0155] 結(jié)果：主要觀察是對細胞完全沒有損傷或毒性，并且沒有任何細菌或真菌污染。
[0156] 圖11 (a，b)中的暴露于ClotBlock制劑的人成纖維細胞培養(yǎng)物中，細胞比對照未 處理的培養(yǎng)物顯得稍微更大或更分散。并且圖12中（a，b)中的在人上皮細胞中也是。
[0157] 結(jié)論：ClotBlock是生物相容的，并且不抑制，而是刺激，細胞的生長和分化；這是 傷口愈合劑的重要屬性。
【主權(quán)項】
1. 一種用于在最小按壓下控制出血的纖維蛋白封閉劑組合物，所述組合物包括： a) 凍干的desAB纖維蛋白II聚合物的層，以及 b) 凍干的凝血酶的層。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，通過纖維蛋白II單體和中和緩沖液的反應來 制備所述纖維蛋白聚合物，以1:1的體積比加入所述中和緩沖液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，還包括基于體積-體積添加的約1 %至約5 %的甘 油。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中，所述中和緩沖液包括： 150mM NaCl, 50mM HEPES， 3mM CaCl2， 0. 12g/mL Activa (非媽依賴的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）；以及 每mL中和緩沖液中的21Lowey單位的XIII因子。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中和緩沖液，其中，所述中和緩沖液的pH為8. 5。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中，使用混合到所述中和緩沖液內(nèi)的非鈣依賴的 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶來交聯(lián)所述纖維蛋白聚合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物的特征為是生物相容的。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，當將所述組合物應用于出血傷口組織時，所述組合 物吸收血液從而形成凝膠，所述凝膠用于在傷口上形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中，在按壓或不按壓的情況下，在將所述組合物應 用于傷口組織的一分鐘內(nèi)實現(xiàn)止血。10. -種控制出血的設備，其中，根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物可以放置在粘合支撐件 上或在沒有支撐件的情況下使用。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的設備，其中，所述粘合支撐件是可生物降解且去除的。12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的設備，其中，所述粘合支撐件是非可生物降解的粘合繃帶。13. 根據(jù)權(quán)利要求所述的組合物，其中，所述纖維蛋白聚合物是在具有各種形狀和尺寸 的模具中凍干的。
【專利摘要】ClotBlock是設計為用作中度至中度出血中的助劑或一級處理的凍干的纖維蛋白止血劑。ClotBlock可以直接應用于開腹手術(shù)過程中的傷口或用作非介入性封閉劑。它的交聯(lián)技術(shù)生成高容量止血所需的強且安全的粘合纖維蛋白封閉劑。結(jié)塊的附著屬性以及纖維蛋白凝塊的快速形成和穩(wěn)定性確保了：取決于傷口的級別，在1分鐘至5分鐘內(nèi)形成強的穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊。該試劑是安全的、生物相容的、可生物降解的并且可以在室溫下儲存一年。
【IPC分類】A61M37/00, A61B17/20
【公開號】CN105007841
【申請?zhí)枴緾N201380074087
【發(fā)明人】喬治·D.·福盧什
【申請人】喬治·D.·福盧什
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2013年12月28日
【公告號】CA2896866A1, EP2938275A1, WO2014106136A1