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      膽酸作為活性成分在制備治療細粒棘球蚴病藥物中的應(yīng)用_2

      文檔序號:9294583閱讀:來源:國知局
      . 2)清洗3遍,每組培養(yǎng)液中加入約2000個原頭節(jié),置37°C,5% C0J?育箱內(nèi)培養(yǎng),在倒置顯微鏡下觀察TUDCA對細粒棘球蝴原頭節(jié)形態(tài)和活力的影響。
      [0028]數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:加藥后24h開始,每組每天均勻抽取200 y L培養(yǎng)液(平均含原頭節(jié)約90-120個),用0. 1%伊紅染色15min,倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)的活力?;铑^節(jié)拒染、不著色,且有活動性;死亡或活力減弱的原頭節(jié)紅染著色,伴有結(jié)構(gòu)破壞。計算每組每天平均死亡率。每隔4d換液一次(每組體系和濃度同第一次加藥時),連續(xù)觀察,直至最大作用濃度的原頭節(jié)全部死亡。實驗重復(fù)三次。實驗2 :CA作用后原頭節(jié)表面結(jié)構(gòu)的變化
      [0029]在測活力的同時,隨機取相對應(yīng)的原頭節(jié)做電鏡,觀察原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)的變化。PBS洗滌3次,每次5min ;置4%戊二醛固定24h。將原頭節(jié)放入濃度為50%、70%、80%、90%、100%的酒精內(nèi)逐級梯度脫水,脫水時間分別為5min、10min、30min、lh至過夜,臨界點干燥,真空噴金L00A,在LE01430VP掃描電子顯微鏡下觀察原頭節(jié)表層超微結(jié)構(gòu)變化。
      [0030]實驗3 :CA作用后原頭節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化
      [0031]在測活力的同時,隨機取相對應(yīng)的原頭節(jié)做電鏡,觀察原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)的變化。PBS洗滌3次,每次5min ;置4%戊二醛前固定24h。用小離心管離心,去除上清液,用瓊脂糖包埋頭節(jié),取出凝膠繼續(xù)放入4%戊二醛內(nèi)固定24h。將固定好的原頭節(jié)用PBS(PH7. 4)沖洗3次,每次15min,2% 0s04中后固定lh,用PBS再沖洗兩遍。酒精逐級梯度脫水,30%—50%— 60%各 10min,70% 過夜,次日再置 80%— 90% 各 lOmin,100% 30min。之后丙酮逐級脫水,環(huán)氧樹脂(Epon812)包埋,固定后修型,LKB2088V型超薄切片機切片,醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色,置于日立H-600型透射電子顯微鏡觀察原頭節(jié)內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化。
      [0032]實驗結(jié)果:
      [0033]參考圖1,為CA體外培養(yǎng)細粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)變化,倒置顯微鏡下觀察,CA作用后的原頭節(jié)多呈外翻型,原頭節(jié)頂突上的小鉤排列紊亂,部分脫落,吸盤突起,變形,活動性減弱或死亡。藥物作用5d后,隨著CA濃度的增加,原頭節(jié)的形態(tài)變化明顯。DMSO組的原頭節(jié)頂突凸出或凹入,體積較大,活動良好.參考圖2,為CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)的殺傷作用。不同濃度 CA (500 ymol/L、1000 ymol/L、2000 ymol/L、3000 ymol/L)體外培養(yǎng) 18d的細粒棘球蝴原頭節(jié)活力測定結(jié)果見圖2,顯示不同濃度CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)均有抑制作用。其中3000 ymol/L CA作用18d原頭節(jié)死亡率達100%。從活力曲線圖中可以看出,隨著藥物濃度的增加和用藥時間的延長,原頭節(jié)的抑制率增加,此作用具有劑量依賴性和時間依賴性。各實驗組原頭節(jié)死亡率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
      [0034]同時,申請人在掃描電子顯微鏡下觀察了 CA作用后的原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)變化,觀察顯示空白對照組原頭節(jié)表面光滑,多呈內(nèi)陷型,頭節(jié)呈球形或橢圓形;用3000 iimol/L CA作用細粒棘球蝴原頭節(jié)5d后,在掃描電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),原頭節(jié)多呈外翻型,頂突破壞、頭鉤缺損、吸盤變形,體表出現(xiàn)許多陷窩,皮層呈蟲蛀樣損害(圖3)。
      [0035]同時,在透射電鏡下觀察,正常培養(yǎng)的細粒棘球蝴原頭節(jié)合胞體帶結(jié)構(gòu)較致密,內(nèi)有大小不等、形狀不一的囊泡,排列較規(guī)則,外側(cè)有較多排列整齊的微毛;原頭節(jié)內(nèi)含有不同類型的細胞,實質(zhì)細胞的核大而明顯,核仁居中,核內(nèi)染色質(zhì)較細膩,異染色質(zhì)較少。CA作用后的細粒棘球蝴原頭節(jié)合胞體帶變薄,結(jié)構(gòu)松散,囊泡擴張,纖毛減少,且排列不規(guī)則;部分實質(zhì)細胞基質(zhì)濃縮,核周隙輕微增寬,核仁消失;合胞體帶和腔內(nèi)出現(xiàn)空泡(圖4)。
      [0036]綜上可以看到,不同濃度CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)均有抑制作用,濃度為3000 ymol/L的CA對細粒棘球蝴原頭節(jié)殺傷作用最明顯,隨著時間的延長,抑制作用顯著增加(P < 0. 01)。在證實CA對原頭節(jié)有抑制作用的基礎(chǔ)上,探索不同濃度的CA對細粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)學(xué)影響。研究結(jié)果顯示,CA作用后,可導(dǎo)致體外細粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)發(fā)生不同程度的改變。內(nèi)陷型和外翻型原頭節(jié)是蟲體不同的存在形式。當(dāng)條件適適宜時,原頭節(jié)頂突內(nèi)凹,可保護頭鉤、吸盤、微毛不受損害;當(dāng)加入CA后,外翻型的原頭節(jié)增多。正常培養(yǎng)的細粒棘球蝴原頭節(jié)生發(fā)層的微毛發(fā)育良好,數(shù)量多,附著并延伸入角質(zhì)層內(nèi),可增加生發(fā)層與角質(zhì)層的接觸面積,有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,在棘球蝴無血液供應(yīng)的情況下仍可較快生長并不斷形成育囊。不同濃度CA作用后的細粒棘球蝴原頭節(jié),在透射電鏡下觀察,微毛出現(xiàn)不同程度的缺損,并且生發(fā)層內(nèi)的細胞被空泡所替代。其不利于形成育囊,使原頭節(jié)的生長受到抑制而死亡。
      [0037]總而言之,CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)有殺傷作用。
      【主權(quán)項】
      1.膽酸作為活性成分在制備治療細粒棘球蝴病藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用,其特征在于膽酸的濃度不低于500ymol/Lo3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用,其特征在于膽酸的濃度為2000-3000μ mol/L。4.膽酸作為活性成分在制備治療囊性肝包蟲病藥物中的應(yīng)用。5.膽酸作為細粒棘球蝴原頭節(jié)抑制劑的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用,其特征在于膽酸的濃度不低于500μ mol/L。7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用,其特征在于膽酸的濃度為2000-3000μ mol/L。
      【專利摘要】本發(fā)明公開了膽酸作為活性成分在制備治療細粒棘球蚴病藥物中的應(yīng)用,以膽酸殺滅細粒棘球蚴病的病原-細粒棘球蚴絳蟲,具有顯著的抑制和殺滅細粒棘球蚴原頭節(jié)的效果,從而實現(xiàn)細粒棘球蚴病的治療。
      【IPC分類】A61K31/575, A61P33/10
      【公開號】CN105012316
      【申請?zhí)枴緾N201510445834
      【發(fā)明人】姜玉峰, 呂海龍, 史紅娟
      【申請人】姜玉峰
      【公開日】2015年11月4日
      【申請日】2015年7月27日
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