）的水中，經(jīng)0. 45ym的濾膜過濾除菌后，制得抗菌藥液，各藥液在4°C條 件下備用。
[0024] (3)檢測各藥液對細菌的最小抑菌濃度（MIC)。即細菌在LB培養(yǎng)基中于37°C條件 下過夜培養(yǎng)，1:15轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)到0D62Q= 0. 2±0. 02。細菌1:10000稀 釋到LB培養(yǎng)基中，加入等體積的藥液，混勻后取相同體積的混合物加入到下一個稀釋度， 一直對倍稀釋到最后一個濃度。陰性對照加入等體積的含體積百分數(shù)2%DMS0的水。
[0025] (4)細菌在37°C條件下培養(yǎng)18-20小時，讀取0D62。，0D62。小于0. 1 (即小于本底數(shù) 值）判定為無細菌生長，試驗結果如表1所示。
[0026]表1
[0027]
[0028] 上述結果表明，當三葉青葉的乙醇提取物的濃度大于等于0.5mg/mL時，能夠抑制 金黃色葡萄球菌ATCC6538的生長；當濃度大于等于0. 5mg/mL，能夠抑制單核細胞增多性李 斯特菌NCTC7973的生長；當濃度大于等于lmg/mL，能夠抑制大腸桿菌ATCC8739的生長。以 上結果說明三葉青葉的乙醇提取物對細菌具有較好的抑制作用，具有抑菌殺菌作用。
[0029] 實施例2
[0030] (1)取干燥的三葉青的葉粉碎得到干粉，用體積百分數(shù)70%的乙醇水溶液提取 90min，干粉的質(zhì)量與乙醇水溶液的體積之比為lg:15mL，過濾，濾液干燥得到三葉青葉的 乙醇提取物；
[0031] (2)三葉青葉的乙醇提取物以16mg/mL的濃度溶解于含體積百分數(shù)2%乙醇的水 中，0. 45iim的濾膜過濾除菌后，制得抗菌藥液，各藥液在4°C條件下備用。
[0032] (3)檢測各藥液對細菌的最小抑菌濃度（MIC)。即細菌在LB培養(yǎng)基中于37°C條件 下過夜培養(yǎng)，1:15轉(zhuǎn)接到新的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)到0D62Q= 0. 2±0. 02。細菌1:10000稀 釋到LB培養(yǎng)基中，加入等體積的藥液，混勻后取相同體積的混合物加入到下一個稀釋度， 一直對倍稀釋到最后一個濃度。陰性對照加入等體積的含體積百分數(shù)2%乙醇的水。
[0033] (4)細菌在37°C條件下培養(yǎng)18-20小時，讀取0D62。，0D62。小于0. 1 (即小于本底數(shù) 值）判定為無細菌生長。試驗結果如表2所示。
[0034]表2
[0035]
[0036] 上述結果表明，當三葉青葉的乙醇提取物的濃度大于等于0.5mg/mL時，能夠抑制 金黃色葡萄球菌ATCC6538的生長；當濃度大于等于lmg/mL，能夠抑制單核細胞增多性李斯 特菌NCTC7973的生長；當濃度大于等于lmg/mL，能夠抑制大腸桿菌ATCC8739的生長。以 上結果說明三葉青葉的乙醇提取物乙酸乙酯部位對細菌具有較好的抑制作用，具有抑菌殺 菌作用。
[0037] 對比例1
[0038] 取干燥的三葉青的根粉碎得到干粉，用體積百分數(shù)50%、75%、95%的乙醇水溶液 提取90min，干粉的質(zhì)量與乙醇水溶液的體積之比為lg:3mL，過濾，濾液干燥得到三葉青的 提取物（即三葉青根的醇提物），加水配制成16mg/mL濃度的抗菌藥液。試驗結果如表3所 示，其中，三葉青根的水提物是指提取溶劑用水代替乙醇水溶液，其他不變。
[0039]表 3
[0040]
[0041] 上述結果表明，16mg/mL的三葉青的根的水提物和醇提物對金黃色葡萄球 菌ATCC6538，單核細胞增多性李斯特菌NCTC7973，大腸桿菌ATCC8739，腸炎沙門氏菌CGMCG50760,銅綠假單胞菌ATCC9027,副溶血弧菌ATCC17082,鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 均無抑制作用。與表1和2結果相比較，三葉青根的水提物和醇提物的抑菌效果要明顯低 于三葉青葉的醇提物。
【主權項】
1. 一種三葉青葉的乙醇提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 取干燥的三葉青的葉粉碎得到干粉，用乙醇水溶液提取，過濾，濾液經(jīng)干燥后得到三葉 青葉的乙醇提取物。2. 根據(jù)權利要求1所述的三葉青葉的乙醇提取物的制備方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液中乙醇的體積百分數(shù)為70%~95%，用乙醇水溶液提取60min~120min。3. 根據(jù)權利要求2所述的三葉青葉的乙醇提取物的制備方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液中乙醇的體積百分數(shù)為95%，用乙醇水溶液提取90min。4. 根據(jù)權利要求1所述的三葉青葉的乙醇提取物的制備方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液的用量為干粉質(zhì)量的5-50mL/g。5. 根據(jù)權利要求4所述的三葉青葉的乙醇提取物的制備方法，其特征在于，所述的乙 醇水溶液的用量為干粉質(zhì)量的15mL/g。6. 根據(jù)權利要求1~5任一項所述的制備方法制備的三葉青葉的乙醇提取物。7. 根據(jù)權利要求6所述的三葉青葉的乙醇提取物在制備抑菌殺菌用品的應用。8. -種抗菌藥液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 將三葉青葉的乙醇提取物溶解于含溶解劑的水中，經(jīng)〇. 2~0. 5 ym的濾膜過濾除菌 后，制得抗菌藥液； 所述的三葉青葉的乙醇提取物的質(zhì)量與含溶解劑的水的體積之比為l_16mg :lmL ; 所述的溶解劑為二甲基亞砜或乙醇，所述的含溶解劑的水中溶解劑的體積百分數(shù)為0?1%~2%〇9. 一種抗菌藥液在制備抑菌殺菌用品中的應用，其特征在于，所述的抗菌藥液采用權 利要求8所述的制備方法制備。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種三葉青葉的乙醇提取物及其制備方法和應用，該制備方法，包括：取干燥的三葉青的葉粉碎得到干粉，用乙醇水溶液提取，過濾，濾液經(jīng)干燥后得到三葉青葉的乙醇提取物。本發(fā)明中，通過乙醇水溶液提取，將三葉青的葉中抑菌和殺菌成分提取出來，最后得到三葉青葉的乙醇提取物，得到的三葉青葉的乙醇提取物。所述的制備方法制備的三葉青葉的乙醇提取物，可用于制備抑菌殺菌用品，用于藥物、化妝品、保健食品、食品以及用于人、動物、水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的抑菌和抗菌，能夠有效抑制細菌生長和殺死細菌。
【IPC分類】A61K36/87, A61P31/04, A01P1/00, A23L1/29, A61K8/97, A01N65/08
【公開號】CN105012551
【申請?zhí)枴緾N201510460189
【發(fā)明人】吳學謙, 俞盈, 蘇慶亮, 熊科輝, 許海順, 徐娟, 吳學良, 樓利明
【申請人】浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月30日