備方法，所述方法包括以下步驟:
[0035]步驟一，以檸檬酸為碳前驅(qū)體，色氨酸為輔助試劑，制備熒光碳點(diǎn)，具體為:
[0036](I)在室溫下，稱取Ig檸檬酸和20mg色氨酸，量取5mL H20，全部移入25mL玻璃反應(yīng)瓶中，把該反應(yīng)瓶放在工作頻率為40kHz，功率200W的超聲中處理lmin，得到均勻的水溶液；
[0037](2)將步驟⑴中得到的水溶液置于家用微波爐中，在800W功率下進(jìn)行微波加熱4min，反應(yīng)后得到棕黃色液體；
[0038](3)使用截留分子量為1000的透析袋，透析步驟二中得到的棕黃色液體，透析時(shí)間為24h，透析過(guò)程中不間斷的更換超純水，以除去未反應(yīng)的檸檬酸和色氨酸，即可得到色氨酸修飾的超強(qiáng)焚光碳點(diǎn)，量子產(chǎn)率為20%。
[0039]步驟一■，以市售桑香絲為原料制備香絲蛋白，具體步驟為:
[0040](I)脫膠。將蠶繭放入0.5wt%的NaHOV^液中煮沸半個(gè)小時(shí)，取出脫膠絲，用去離子水沖洗3?4次，最后放入40°C的恒溫干燥箱中烘干得到絲素纖維。
[0041](2)絲素溶解。將蠶絲蛋白置于CaCl2-C2H5OH-H2O(摩爾比為:1:2:8)的三元體系中溶解，90 °C保持12h。
[0042](3)純化。將溶解后的溶液以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min除去雜質(zhì)，然后溶液置于透析袋中，在去離子水中透析三天，期間定期換水，以除去溶液中的鹽離子。溶液透析好后置于4°C的冰箱中待用。取部分溶液冷凍干燥進(jìn)行定量。
[0043]步驟三，以碳點(diǎn)和蠶絲蛋白為前驅(qū)體合成具有三角體型的SF@C-dots復(fù)合納米顆粒，具體為:
[0044](I)乙醇-水混合冷凍法制備蠶絲蛋白-碳點(diǎn)復(fù)合納米粒子。1ml冰水中加入1.5ml碳點(diǎn)溶液，混合后碳點(diǎn)濃度為lug/ml，保持零度，然后加入200ul lmg/ml的蠶絲蛋白水溶液，繼續(xù)攪拌1min后，逐滴加入Iml 0°C的乙醇，以后間隔1min在攪拌下逐滴加入Iml O0C的乙醇，加入乙醇的總量為6ml，繼續(xù)攪拌30min后轉(zhuǎn)入_20°C冰箱保持48小時(shí)后取出。
[0045](2)純化。采用乙醇-水洗離心分離。取沉淀，定量分散在水中。
[0046]上述實(shí)施例中，熒光碳點(diǎn)、蠶絲蛋白和水的質(zhì)量比為1:5:50?1:20:100，在該范圍內(nèi)均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，比如1:5:50,1:20:100以及這兩個(gè)之間的比例ο
[0047]實(shí)施例2
[0048]以實(shí)施例1制備得到的SFOC-dots為藥物載體，選擇鹽酸阿霉素(DOX)為藥物，以MTT法研究納米顆粒體體外靶向進(jìn)細(xì)胞以及治療效果。
[0049]步驟一:不同載藥濃度的SF@C-dots-D0X和SFOC-dots與MGC-803胃癌細(xì)胞共孵育48小時(shí)。
[0050]步驟二:采用MTT法，測(cè)定癌細(xì)胞的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SF@C-dots對(duì)癌細(xì)胞沒有明顯的抑制作用，即使當(dāng)濃度達(dá)到400 μ g/ml時(shí)，共孵育48小時(shí)后，癌細(xì)胞的活性依然在90%以上。說(shuō)明蠶絲蛋白納米粒子對(duì)細(xì)胞沒有毒性。與此同時(shí)，當(dāng)SF@C-dots-D0X中阿霉素的載藥量為10 μ g/ml時(shí)，細(xì)胞的活性顯著下降，在40%以下，說(shuō)明SFOC-dots-DOX可以有效地殺傷癌細(xì)胞。
[0051]圖1a和圖1b為實(shí)施例1備的碳量子點(diǎn)的掃描電鏡圖SEM圖，從中可以看出，SFOC-dots顆粒具有三角體形，顆粒分散性較好；
[0052]圖2a是實(shí)施例1備的碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜，表征紫外吸收性質(zhì)；
[0053]圖2b是實(shí)施例1方法制備的碳量子點(diǎn)的紅外光譜，氨基的特征吸收峰分別出現(xiàn)在3432cm \ 1661_1590cm \ 1436_1332cm、1171_1035cm 1 有吸收峰。
[0054]圖3是實(shí)施例1備的SFOC-dots顆粒分散在水溶液中的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖，表明SFOC-dots顆粒的具有良好熒光性質(zhì)；
[0055]圖4實(shí)施例2濃度SF@C-dots和SFOC-dots-DOX對(duì)MGC803細(xì)胞活性的抑制作用(不同濃度SF@C-dots和SF@C-dots-D0X和MGC803細(xì)胞共孵育48小時(shí)后，用MTT法測(cè)定細(xì)胞的活性)。
[0056]綜上所述，本發(fā)明旨在采用乙醇-水混合冷凍法合成焚光SF@C-dots顆粒的新方法，醇-水合成體系，操作安全、快捷方便、生物安全性好并且產(chǎn)率高。
[0057]本發(fā)明提供的一直以蠶絲蛋白和熒光碳點(diǎn)為前驅(qū)體，合成了一種具有三角體型結(jié)構(gòu)具有熒光性能的SFOC-dots復(fù)合納米顆粒，其熒光量子點(diǎn)產(chǎn)率高達(dá)20?40%，產(chǎn)率高，方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，易于擴(kuò)大化生產(chǎn)。復(fù)合納米顆粒表面富含氨基，對(duì)PH敏感，有望在生物標(biāo)記、疾病探測(cè)，藥物輸送和緩釋載體等實(shí)現(xiàn)影像介導(dǎo)下的綜合治療等方面，具有廣闊的應(yīng)用前景；合成方法簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊的設(shè)備，因此合成成本低廉；分離提純簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，在一般實(shí)驗(yàn)室均能完成，易于規(guī)?；屯茝V。
[0058]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟一，采用氨基酸或者生物活性酶為表面活性劑合成熒光碳點(diǎn)； 步驟二，將天然的桑蠶繭經(jīng)脫膠-絲素溶解-分離提純，制備高純蠶絲蛋白透明水溶液； 步驟三，在冷凍和磁力攪拌的條件下，將熒光碳點(diǎn)和蠶絲蛋白充分的混合于水溶液中，逐滴加乙醇，滴加完成后，繼續(xù)攪拌，混合反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)移到冷凍冰箱內(nèi)靜置反應(yīng)，然后取出，透析法除去未反應(yīng)物，得到具有三角體型結(jié)構(gòu)的熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒。2.如權(quán)利要求1所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述桑蠶繭是指家養(yǎng)桑蠶。3.如權(quán)利要求1所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述熒光碳點(diǎn)、蠶絲蛋白和水的質(zhì)量比為1:5:50?1:20:100。4.如權(quán)利要求1所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述在冷凍和磁力攪拌的條件下，其中冷凍溫度為O?4°C。5.如權(quán)利要求1所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述攪拌的攪拌速度在200?1000r/min。6.如權(quán)利要求5所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述攪拌的時(shí)間為30?60min。7.如權(quán)利要求1所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述混合反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)移到冷凍冰箱內(nèi)靜置反應(yīng)，其中:冷凍冰箱溫度為-18°C?_70°C，反應(yīng)時(shí)間為12?72h。8.如權(quán)利要求1所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述乙醇的量為0.1?80%。9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述氨基酸為色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸中一種，所述生物活性酶為核糖核酸酶。10.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述乙醇純度為分析純。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種三角體型熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒的制備方法；包括以下步驟：步驟一，采用氨基酸或者生物活性酶為表面活性劑合成熒光碳點(diǎn)；步驟二，將天然的桑蠶繭經(jīng)脫膠-絲素溶解-分離提純，制備高純絲素透明水溶液；步驟三，在冷凍和磁力攪拌的條件下，將熒光碳點(diǎn)和蠶絲蛋白充分的混合于水溶液中，逐滴加乙醇，滴加完成后，繼續(xù)攪拌，混合反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)移到冷凍冰箱內(nèi)靜置反應(yīng)，然后取出，透析法除去未反應(yīng)物，得到具有三角體型結(jié)構(gòu)的熒光絲素-碳點(diǎn)復(fù)合納米顆粒。本發(fā)明方法利用納米顆粒表面的蠶絲蛋白對(duì)pH敏感性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)藥物在特定部位的控制釋放，在藥物靶向運(yùn)輸和控制釋放方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K49/00, A61K47/42, C09K11/65
【公開號(hào)】CN105012962
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510310085
【發(fā)明人】沈廣霞, 胡美昕, 劉慧旸, 崔大祥
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年6月8日