動物雙歧桿菌動物亞種菌株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的動物雙歧桿菌動物亞種（Bifidobacterium animalis ssp. animal is)菌株。此菌株尤其能夠通過增加腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS)的血管活性腸肽（VIP)水平 來改善腸神經(jīng)系統(tǒng)的功能，以例如促進腸道運動性或屏障完整性的功能。因此，此菌株可用 于預防和/或減輕胃腸不適或胃腸疾病。
【背景技術】
[0002] 腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS)是整合的神經(jīng)系統(tǒng)，其沿腸道形成2個主要的具有功能特異性 作用的神經(jīng)叢（Furness, J. Auton. Nerv. Syst.，81 (1-3) : 87-96, 2000)。位于縱肌和環(huán)狀肌 之間的腸肌叢包含主要參與控制胃腸（GI)運動性的神經(jīng)元。位于環(huán)狀肌和粘膜之間的黏 膜下神經(jīng)叢包含主要參與控制腸上皮屏障（IEB)功能的神經(jīng)元。腸神經(jīng)元通過釋放作用于 腸神經(jīng)元支配的靶細胞的神經(jīng)介質(zhì)來控制GI功能。
[0003] 對于消化系統(tǒng)，神經(jīng)介質(zhì)VIP誘導平滑肌松弛（低級食管括約肌、胃和膽囊）、刺激 水分泌至胰液和膽汁中，并使得抑制胃酸分泌和自腸腔中的吸收。其在腸道中的作用是極 大地刺激了水和電解質(zhì)的分泌，以及擴張腸平滑肌、擴張周邊血管、刺激胰碳酸氫鹽的分泌 并抑制由胃泌素刺激的胃酸分泌。這些影響共同作用以增強運動性。因此，增加VIP有益 地改善了胃腸道肌肉的松弛。
[0004] 腸上皮屏障由極化的特異化細胞的連續(xù)單層構成，特異化細胞通過控制屏障滲透 性以及上皮細胞極性的緊密的連接相關蛋白如緊密連接蛋白-l(ZO-l)而聚在一起。體 外和體內(nèi)的研究表明，益生菌可以通過調(diào)節(jié)Z0-1來影響上皮抵抗力并降低滲透性（Eun 等人，APMIS, 119(1) : 49-56, 2011 ;Miyauchi 等人，J. Dairy Sci.，92(6) : 2400-8, 2009)。 由ENS合成的神經(jīng)介質(zhì)也參與了腸道滲透性調(diào)節(jié)（H丨:illgren等人，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，275:G95_103,1998 ;Hayden 等人，Am.J. Physiol. Regul.Integr.Comp.Physiol.，278:R1589-94,2000;Neunlist 等人，Am.J.Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，285 (5) :G1028_36, 2003)。例如，在由新生兒母體分離所 誘導的結腸中的增強的乙酰膽堿的神經(jīng)元合成導致了大鼠中上皮細胞旁滲透性的增加 (Gareau 等人，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，293: G198-203, 2007)。相比 之下，由粘膜下神經(jīng)元所釋放的血管活性腸肽（VIP)通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白Z0-1在腸上皮 細胞中的表達增加了 IEB 的抵抗力（NeunliSt 等人，J. Intern. Med.，263(6) : 577-83, 2008) 進一步增強VIP在調(diào)節(jié)屏障功能中的作用的最近研究表明VIP增加了在小鼠的由鼠類檸 檬酸桿菌（Citrobacter rodentium)誘導的結腸炎中的屏障抵抗力（Conlin等人，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，297(4):G735_50, 2009)〇
[0005] 數(shù)項研究測量了 一些益生菌對ENS神經(jīng)介質(zhì)（包括VIP)的作用。Kamm等人 (Neurogastrointest. Motil.，16:53-60, 2004)公開了 布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii)對減少鈣結合蛋白-28k (CALB)的作用，而對豬空腸的其它神經(jīng)元標 記物（ChAT、VIP、SP、NF_l6〇 等）沒有作用。Metugriachuk 等人（Rejuvenation Res.，9:342-345, 2006)公開了在年老的Wistar大鼠的小腸和大腸的運動性上的共生制備 顯著地增加了小腸和結腸的肌電活性，并導致VIP的mRNA表達增加，但對VIP濃度沒有顯 著的作用。
[0006] 已知細菌菌株可提供與健康相關的益處。這樣的菌株通常被稱為益生菌，并用于 食品。需要新的可以引入到食品中且具有改良的與健康相關的益處和/或其它益處如感官 性質(zhì)和/或可加工性的菌株。
[0007] 在國際申請W0 2011/148219中，發(fā)現(xiàn)包括乳酸菌的組合物在ENS中增加了 VIP水 平，從而提高了 ENS功能。這些乳酸菌尤其是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)CNCM 1-4318、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve) CNCM 1-2219、動物雙歧桿菌乳酸菌亞種 (Bifidobacterium animalis ssp.lactis)CNCM 1-2494 和短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve)CNCM 1-4321。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在本文中，本發(fā)明人鑒定了一種新的細菌菌株，特別地，其尤其可以調(diào)節(jié)腸神 經(jīng)系統(tǒng)以促進腸道運動性和屏障完整性功能，并且特別地，其所增加的VIP水平多于TO 2011/148219中所公開的菌株。此菌株被歸類為動物雙歧桿菌動物亞種菌株，并根據(jù)布達 佩斯條約在2012年3月6日保藏于作為國際保藏機構的CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，法國國家微生物保藏中心），編號1-4602。
[0009] 因此，本發(fā)明涉及動物雙歧桿菌動物亞種CNCM 1-4602菌株。
[0010] 此菌株的特征如下：
[0011] -菌落形態(tài)（固體MRS+半胱氨酸，于37°C 72h，厭氧條件）：小的、圓形的且白的、 規(guī)則的且半透明的菌落；
[0012] -微觀形態(tài)（液體MRS+半胱氨酸，于37°C 16h，厭氧條件）：厚的、大的、兩極的、萌 蘆形桿菌；
[0013]-下列底物的發(fā)酵（API 50CH條上，API MRS培養(yǎng)基中，于37°C48h) :L-阿拉伯糖、 D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-蜜二糖、D-蔗糖和D-棉子糖；
[0014]-生化鑒定（API 20A條上，API 20A培養(yǎng)基中于36°C 24h):無芽孢，革蘭氏染色 陽性，棒狀，在存在D-葡萄糖、D-蔗糖、D-麥芽糖、水楊苷、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-棉子 糖、明膠和七葉苷水解作用的情況下酸化；
[0015]-所檢測到的酶活性（API ZYM條上，于37°C 4h):酯酶（C4)、亮氨酸芳基酰胺酶、 胱氨酸芳基酰胺酶、a-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶和a-葡糖苷酶。
[0016] 本發(fā)明還包括衍生自本發(fā)明的菌株的仍對VIP有活性的突變菌株或遺傳轉化菌 株。這些突變體或遺傳轉化菌株可以是其中一種或多種親本菌株的內(nèi)源基因被突變的菌 株，例如以修改其一些代謝性質(zhì)（例如其發(fā)酵糖類的能力、其對酸度的抗性、其運送至胃腸 道的生存力、其后酸化或其代謝物生產(chǎn)）。它們還可以是用一個或多個目標基因遺傳轉化親 本菌株所獲得的菌株，例如以賦予所述菌株另外的生理特征，或以使其表達希望通過所述 菌株施用的具有治療或疫苗興趣的蛋白。
[0017] 本發(fā)明的菌株以及如上所定義的突變體可用作益生菌。其可用于預防和/或減輕 胃腸不適或胃腸疾病。菌株增加了受試者中腸神經(jīng)系統(tǒng)的血管活性腸肽（VIP)水平。其可 以在施用后抑制食品和/或受試者中的病原體的生長。其可以例如通過增加腸上皮細胞的 跨上皮電阻（TEER)來提供改善的腸道屏障性質(zhì)。其可以借由發(fā)酵和/或消化提供目標短 鏈脂肪酸的生產(chǎn)，例如增加的產(chǎn)量或改善的脂肪酸組成。其可以借由發(fā)酵和/或消化提供 降低的氣體產(chǎn)生。其可以對胃應激具有感興趣的抵抗力。其可以例如為新生哺乳動物尤其 是新生人類提供良好的胃腸運動行性質(zhì)。其可以促進腸神經(jīng)系統(tǒng)和腸道功能以及胃腸運動 性的成熟，從而尤其是降低胃腸轉運時間、增加胃腸肌肉收縮力、改善胃腸蠕動、預防延遲 的胃排空、增加胃腸系統(tǒng)的協(xié)調(diào)收縮、降低胎糞排泄時間、降低出生后胃腸運動開始的時間 并允許在新生哺乳動物例如新生人類出生后的早期腸道喂養(yǎng)。此菌株可以例如在存在維生 素K的情況下在發(fā)酵乳制品中呈現(xiàn)出良好的生長和/或存活。
[0018] 本發(fā)明還涉及包含一種或多種其它的（益生的或非益生的）細菌菌株的組 合物，例如一種或多種選自乳桿菌（Lactobacillus)、乳球菌（Lactococcus)、鏈球菌 (Streptococcus)和雙歧桿菌（Bifidobacteria)屬的細菌菌株。特別地，這類其它菌株可 包括一種或多種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)的菌株和/或一種或多種保 加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus)的菌株。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的這一組合物可有利地包括選自短雙歧桿菌CNCM 1-4321、短雙歧桿 菌CNCM 1-2219、動物雙歧桿菌乳酸菌亞種CNCM 1-2494、植物乳桿菌CNCM 1-4318、兩歧雙 歧桿菌CNCM 1-4319和鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4316中的至少一種細菌菌株。兩歧雙歧桿菌 CNCM 1-4319和鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4316公開于國際申請W0 2011/148220。
[0020] 本發(fā)明的組合物可以是任何適于給藥的形式，尤其是口服給藥。這包括例如固體、 半固體、液體和粉劑。通常優(yōu)選液體組合物以易于給藥，例如作為飲料。
[0021] 本發(fā)明的組合物的實例是包括食品的營養(yǎng)組合物。組合物可以是例如乳制品，優(yōu) 選發(fā)酵乳制品。任選地，可以存在其它的乳酸菌菌株。在一個優(yōu)選的實施方式中，存在嗜熱 鏈球菌和保加利亞乳桿菌菌株。發(fā)酵產(chǎn)品可以是液體形式或由干燥發(fā)酵液所獲得的干燥粉 末形式。優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)品是新鮮產(chǎn)品。新鮮產(chǎn)品（其沒有經(jīng)歷劇烈的熱處理步驟）具有 細菌菌株以活的形式存在的優(yōu)點。發(fā)酵產(chǎn)品可以尤其是乳制品，更優(yōu)選的是發(fā)酵乳和/或 發(fā)酵乳清。例如，營養(yǎng)組合物是凝固的、攪拌的或可飲用形式的酸奶或發(fā)酵乳。發(fā)酵產(chǎn)品也 可以是干酪或發(fā)酵植物，如凝固的、攪拌的或可飲用形式的發(fā)酵大豆、谷物和/或水果。本 發(fā)明的營養(yǎng)組合物可以是嬰兒食品、嬰兒配方奶粉或后續(xù)嬰兒配方奶粉。
[0022] 本發(fā)明的組合物還可以是營養(yǎng)產(chǎn)品或藥物產(chǎn)品、營養(yǎng)補充劑或醫(yī)療食品。
[0023] 本發(fā)明的營養(yǎng)組合物還包括食品補充劑和功能食品。"食品補充劑"是指由通常在 食品中使用的化合物所制造的產(chǎn)品，但所述化合物通常為與養(yǎng)料（aliment)無關的片劑、 粉劑、膠囊劑、飲劑或任何的其它形式，并且對人的健康具有有益作用。"功能性食品"是也 對人的健康具有有益作用的滋