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      用于治療關(guān)節(jié)損壞的肽和組合物的制作方法

      文檔序號:9307576閱讀:479來源:國知局
      用于治療關(guān)節(jié)損壞的肽和組合物的制作方法
      【專利說明】用于治療關(guān)節(jié)損壞的肽和組合物
      [0001] 相關(guān)申請
      [0002] 本申請要求2013年3月8日遞交的美國臨時專利申請?zhí)?1/775, 400和2014年2 月10日遞交的美國臨時專利申請?zhí)?1/938, 123的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益,所有這些文獻均完整地 特此并入作為參考。
      [0003] 發(fā)明背景
      [0004] 骨關(guān)節(jié)炎(0A)是最常見的肌肉骨骼紊亂。大約4千萬美國人目前患有0A ;預(yù)計該 數(shù)目在接下來的20年里會由于群體老齡化和壽命的增加而增加到6千萬,從而導(dǎo)致0A成 為第四大致殘原因。0A的特征在于,緩慢的關(guān)節(jié)退行性破壞,包括關(guān)節(jié)軟骨(含有為關(guān)節(jié)提 供潤滑和緩沖的細胞和基質(zhì))和位于關(guān)節(jié)軟骨下方的軟骨下骨。0A可以被認為是各種病因 學(xué)因素的后果。例如,它可以由關(guān)節(jié)軟骨或骨的異常生物機械壓力或遺傳性或獲得性異常 而引起。目前0A治療包括使用口服NSAID或選擇性環(huán)加氧酶2 (C0X-2)抑制劑緩解疼痛、 關(guān)節(jié)內(nèi)(IA)注射活性劑例如皮質(zhì)類固醇和透明質(zhì)酸、以及手術(shù)方法。
      [0005] 關(guān)節(jié)損壞例如急性關(guān)節(jié)損傷,例如半月板或韌帶撕裂、或關(guān)節(jié)內(nèi)骨折,也可以導(dǎo)致 關(guān)節(jié)炎,例如創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)炎。由于關(guān)節(jié)軟骨具有有限的修復(fù)能力,甚至小的不可檢測的損傷 也常??赡茈S時間而惡化并導(dǎo)致0A。目前關(guān)節(jié)損傷的治療可以包括手術(shù)和聚焦于使受傷關(guān) 節(jié)再生的其它侵入性方法,以及用活性劑治療以減少疼痛和炎癥。
      [0006] 間充質(zhì)干細胞(MSCs)存在于成年關(guān)節(jié)軟骨中,分離后可以在體外程序化以分 化為軟骨和其它間充質(zhì)細胞譜系,并可以用于軟骨再生。部分地,該過程受生長因子 (TGF 0 s,BMPs)、血清條件和細胞-細胞接觸的調(diào)節(jié)。W02011/008773描述肽組合物及其用 于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷的用途和用于誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞分化為軟骨細胞的用途。此 外,W02011/008773描述小分子化合物、組合物及其用于改善關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷的用途和用 于誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞分化為軟骨細胞的用途。
      [0007] 盡管手術(shù)技術(shù)和再生技術(shù)已經(jīng)在軟骨恢復(fù)、延緩?fù)嘶透纳脐P(guān)節(jié)損壞的修復(fù)上取 得了一些進展,但是仍持續(xù)需要用于有效軟骨再生、治療關(guān)節(jié)損壞、和改善或防止0A的改 良組合物和方法。
      [0008] 發(fā)明概述
      [0009] 本發(fā)明涉及鑒定新的血管生成素樣3(ANGPTL3)多肽和蛋白質(zhì)變體,所述變體具 有改善的藥物性質(zhì),例如比野生型ANGPTL3更穩(wěn)定、更不易于發(fā)生蛋白水解和酶促降解。本 發(fā)明還提供在哺乳動物中用于治療關(guān)節(jié)損壞或關(guān)節(jié)損傷的組合物和方法、和改善或預(yù)防關(guān) 節(jié)炎、關(guān)節(jié)損壞或關(guān)節(jié)損傷的方法。
      [0010] 因此,本發(fā)明提供蛋白酶抗性多肽,其包含與選自表1序列之任一或多個的氨基 酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性、或至少96%,97%,98%,99%或100%氨基酸序 列同一性的氨基酸序列,如本文進一步描述。表1的修飾多肽在位置423包括非K或R的 極性氨基酸,其中所述位置參照全長ANGPTIL3多肽序列SEQ ID N0:1確定。一些實施方案 中,參照SEQ ID NO: 1確定的位置423的氨基酸是Q或S。一些實施方案中,參照SEQ ID NO: 1確定的位置423的氨基酸是Q。一些實施方案中,參照SEQ ID NO: 1確定的位置423 的氨基酸是S。一些實施方案中,參照SEQ ID NO: 1確定的位置423的氨基酸缺失。此外, 提供的多肽具有軟骨發(fā)生活性。
      [0011] 一些實施方案中,多肽包含與 SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和SEQ ID NO:70中任一個具有至少95 %同一性或至少 96 % ,97 % ,98 % ,99 %或100 %同一性的序列。一些實施方案中,多肽包含與SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID N0:60,SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:62,SEQ ID N0:63,和 SEQ ID N0:64 中任一個具有至少 95%同一性或至少96% ,97% ,98% ,99%或100%同一性的序列。一些實施方案中,多 肽包含表1中的任一序列。一些實施方案中,多肽包含SEQ ID N0:30,SEQ ID N0:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和 SEQ ID NO:70 中的任一個。一些實施方案中, 多肽包含 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:63,和SEQ ID N0:64中的任一個。一些實施方案中,多肽是表1中 的任一序列。一些實施方案中,多肽是 SEQ ID N0:30,SEQ ID N0:31,SEQ ID N0:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41,SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69,和SEQ ID NO: 70中的任一個。一些實施方案中,多肽是SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21,SEQ ID N0:22, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:58, SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61,SEQ ID N0:63,和 SEQ ID N0:64 中的任一個。
      [0012] 本發(fā)明多肽可以并入一種或多種化學(xué)修飾(例如,PEG化)。一些實施方案中,本 發(fā)明多肽可以以融合蛋白的形式包含異源肽,其中所述異源肽可以任選地融合在該多肽的 氨基端或羧基末端。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸;包含編碼該多肽的多核苷 酸的載體;和包含該載體的宿主細胞。
      [0013] 本發(fā)明還提供包含本發(fā)明多肽和可藥用載體的藥物組合物。該組合物可以用于本 文所述的在患者中治療、改善或防止關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)損壞的方法中,其中該方法包括向患者 的關(guān)節(jié)施用治療有效量的本發(fā)明藥物組合物??梢缘靡嬗谠摲椒ǖ牟“Y實例包括,但不限 于關(guān)節(jié)炎(例如,骨關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎)、和關(guān)節(jié)損壞(例如,急性關(guān)節(jié)損傷)。
      [0014] 本發(fā)明還提供治療個體的方法,包括施用治療有效量的本發(fā)明多肽。所提供的方 法包括治療罹患或有危險罹患關(guān)節(jié)損壞和/或關(guān)節(jié)炎的個體,包括向個體施用治療有效量 的一種或多種本發(fā)明多肽或其藥物組合物。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細 胞的方法,包括使間充質(zhì)干細胞接觸有效量的本發(fā)明多肽以誘導(dǎo)該間充質(zhì)干細胞分化為軟 骨細胞。
      [0015] 本發(fā)明的這些和其它方面,包括其它特征、優(yōu)點和實施方式,將在以下詳細描述和 后附本發(fā)明權(quán)利要求書中進一步詳細地描述和闡釋。
      [0016] 附圖簡述
      [0017] 圖1描述經(jīng)工程化的hANGPTL3蛋白的示意圖,該工程化改善蛋白穩(wěn)定性和增強蛋 白水解抗性。在野生型蛋白和肽序列的蛋白生產(chǎn)過程中,在Lys423和Ser424之間觀察到 100%的斷裂。為了減少蛋白水解,產(chǎn)生了各種突變肽,其中Lys 423被突變?yōu)镚in或Ser; 或Ser424被突變?yōu)門hr ;或Lys 423被缺失。
      [0018] 圖2A和B描述在ANGPTL3和工程化構(gòu)建體存在或不存在時軟骨特異性蛋白質(zhì)的 表達。對固定的細胞進行(2A)2A型前膠原定量(PIIANP)或(2B)II型膠原定量,以確定在 實施例中所述處理后分化為軟骨細胞的細胞%。圖2C描述在ANGPTL3或工程化構(gòu)建體存 在或不存在時血管發(fā)生測定試驗的定量結(jié)果,其中與陽性對照蛋白bFGF比較??偣荛L度和 分支點數(shù)量是血管發(fā)生的定量量度。盡管其他人已經(jīng)報道了 ANGPTL3的血管發(fā)生活性,且 本研究證實活性與FGF的活性一樣好;但是結(jié)果說明在C端ANGPTL3構(gòu)建體中沒有顯著活 性保留。
      [0019] 圖3顯示在ANGPTL3或工程化構(gòu)建體存在時軟骨特異性蛋白質(zhì)表達的增加。3A.在 處理后10天使用qRT-PCR評價細胞,以測量在所述處理后軟骨特異性蛋白的RNA表達。 Lubricin,聚集蛋白聚糖(aggrecan)和Sox9代表軟骨相關(guān)蛋白;IGF和IFITM1代表分化 潛力,骨鈣蛋白(osteocalcin)和X型膠原代表骨/纖維化相關(guān)蛋白。3B.在所述處理后3 天評價細胞。用工程化構(gòu)建體或野生型ANGPTL1C端區(qū)多肽處理后,觀察到增加的聚集蛋白 聚糖表達。
      [0020] 圖4顯示ANGPTL3和工程化構(gòu)建體的軟骨保護活性。4A?糖胺聚糖(GAG)釋放(基 質(zhì)損壞的一個指標)隨著遞增量的ANGPTL3和突變構(gòu)建體而被抑制。使用在所示構(gòu)建體存 在或不存在下處理的牛軟骨,實施離體GAG釋放(基質(zhì)損壞的一個指標)抑制試驗。4B和 4C :使用遞增量的ANGPTL3和所示工程化構(gòu)建體抑制了 N0釋放。在所示構(gòu)建體存在或不 存在時處理軟骨細胞,之后實施Greiss反應(yīng)試驗,以確定N0釋放抑制作用作為軟骨保護指 標。
      [0021] 圖5顯示在肥大病況下構(gòu)建體存在時X型膠原表達(纖維軟骨形成活性的指標) 的抑制。在肥大病況下在所示構(gòu)建體存在或不存在的情況下處理原代軟骨細胞,之后通過 免疫熒光評估,以確定X型膠原表達,作為纖維及肥大軟骨形成/軟骨細胞分化的量度。5A 描述野生型C端ANGPTL3或工程化構(gòu)建體的結(jié)果。5B描述C端ANGPTL3 (WT)或工程化構(gòu)建 體242KQ或242Kdel或C端ANGPTL1的結(jié)果。
      [0022] 圖6示意性顯示給藥范例(6A),之后圖示(6B)用小鼠ANGPTL3(17-460)處理后關(guān) 節(jié)嚴重度的改善(通過股骨外側(cè)課(lateral femoral condyle)的軟骨侵蝕評分測定)。
      [0023] 圖7顯示,在手術(shù)誘導(dǎo)軟骨損壞和隨后用ANGPTL3構(gòu)建體每周一次持續(xù)三周(始 于第7日)處理后,小鼠中的失能測量結(jié)果(疼痛指標)。7A顯示手術(shù)后第35天的失能測 量結(jié)果;7B顯示手術(shù)后第56天進行測量的結(jié)果。
      [0024] 圖8顯示,在3次ANGPTL3構(gòu)建體(所示)的每周一次處理(第7、14和21天) 后,對于小鼠中膠原酶誘導(dǎo)的軟骨損壞,關(guān)節(jié)嚴重度的總得分和嚴重度的改善。
      [0025] 圖9顯示,在用工程化ANGPTL3構(gòu)建體處理后,在關(guān)節(jié)損壞的大鼠半月板撕裂模型 中的結(jié)果。圖9A圖示處理后5周關(guān)節(jié)中的蛋白聚糖含量;圖9B圖示處理后5周股骨關(guān)節(jié) 嚴重度得分。結(jié)果說明,在3次ANGPTL3構(gòu)建體(所示)的每周一次處理(第7、14和21 天)后,對大鼠中手術(shù)切斷半月板誘導(dǎo)的軟骨損壞的改善。
      [0026] 圖10顯示,在用工程化ANGPTL3構(gòu)建體處理后,在關(guān)節(jié)損壞的大鼠半月板撕裂模 型中的結(jié)果。圖10A圖示通過嚴重度、番紅菌素(safranin)O強度、軟骨面積和軟骨厚度測 定的體內(nèi)修復(fù)百分數(shù)。圖10B顯示,在手術(shù)誘導(dǎo)軟骨損壞和隨后處理后,大鼠中的失能測量 結(jié)果(疼痛指標)。
      [0027] 圖11圖示總體嚴重度的總得分,以說明:自第4天開始每兩周一次給藥(各 1. 5ug/劑或15ug/劑)后或僅在第7天給藥(單個30 y g劑量)后,犬中由手術(shù)破壞內(nèi)側(cè) 半月板(medial meniscus)誘導(dǎo)的軟骨損壞的改善。
      [0028] 發(fā)明詳述
      [0029] 本發(fā)明至少部分地基于鑒定到可以刺激間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細胞并對蛋 白酶(例如胰蛋白酶樣蛋白酶)切割具有抵抗性的血管生成素樣3(ANGPTL3)多肽。 TO2011/008773描述ANGPTL3肽組合物及肽組合物用于治療或預(yù)防關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷的 用途和用于誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞分化為軟骨細胞的用途。我們發(fā)現(xiàn)野生型ANGPTL3蛋白易于 發(fā)生蛋白酶剪切和不穩(wěn)定,由此鑒定了減輕該效應(yīng)的序列變體。本發(fā)明由此提供用于修復(fù) 軟骨的改良肽組合物。尤其是,提供了根據(jù)本發(fā)明修飾的ANGPTL3肽,該修飾肽與野生型 ANGPTL3多肽相比具有增加的蛋白酶抗性。本發(fā)明還提供用于施用ANGPTL3多肽以預(yù)防或 改善關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)損傷的組合物和方法,其中向關(guān)節(jié)、軟骨組織、或軟骨鄰近組織中、或全 身性地施用本發(fā)明多肽。此外,本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細胞的組合 物和方法。
      [0030] 定義
      [0031] 術(shù)語"蛋白酶抗性"在本文中指包含修飾的多肽,所述修飾可以使該多肽與相應(yīng)的 未修飾野生型多肽相比更不容易被胰蛋白酶樣蛋白酶切割。在特定實施方案中,蛋白酶抗 性多肽是,相對于天然野生型肽序列,在R或K殘基上具有氨基酸替代的ANGPTL3多肽。
      [0032]"ANGPTL3"指血管生成素蛋白家族的成員。ANGPTL3(GenBank登錄號NP_055310. 1) 的氨基酸序列示于SEQ ID N0:1中;相應(yīng)的多核苷酸序列示于SEQ ID N0:2(NCBI參考序 列號 NM014495. 2,其中 ANGPTL3 編碼序列包含 SEQ ID N0:2 的 nt 52-1434)。"ANGPTL3 多 肽"指天然表達的多肽。為了本公開的目的,氨基酸編號典型地參考全長野生型人ANGPTL3 多肽序列(SEQ ID N0:1)確定。因此,在本發(fā)明多肽僅含有全長ANGPTL3的C端部分而不 含N端部分的實施方案中,盡管該肽的長度小于460個氨基酸,但位置仍基于SEQ ID NO: 1 編號。例如,提及本發(fā)明ANGPTIL3多肽的位置423,即使該本發(fā)明ANGPTIL3多肽本身可能 僅200個氨基酸長度,也指SEQ ID NO: 1的位置423??梢酝ㄟ^最佳比對序列,例如,使用默 認CLUSTAL比對參數(shù)或默認BLAST2比對參數(shù),并比較序列,以確定與參考序列例如SEQ ID NO: 1中的位置"相應(yīng)"的目的序列中的氨基酸。例如,"參考SEQ ID NO: 1確定"的目的序 列的位置423、或"相應(yīng)于" SEQ ID NO: 1位置423的氨基酸,指當(dāng)目的序列與SEQ ID NO: 1 最佳比對后,與SEQ ID NO: 1的位置423對齊的氨基酸。
      [0033] 術(shù)語"肽模擬物"(peptidomimetic)和"模擬物"指合成的化學(xué)化合物,該化合物 與天然或非天然的多肽(例如ANGPTL3)具有實質(zhì)上相同的功能特征,但不同的(盡管典 型地是相似的)結(jié)構(gòu)特征。肽類似物在本領(lǐng)域中通常用作和模板肽具有類似性質(zhì)的非肽 活性化合物(例如藥物)。此類非肽化合物被稱為"肽模擬物"("peptide mimetics〃或 〃peptidomimetics〃)(Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986) ;Veber and Freidinger TINS p.392 (1985) ;and Evans et al.J. Med. Chem. 30:1229 (1987))。與治療有用肽結(jié)構(gòu) 相似的肽模擬物可以用于產(chǎn)生等同或增強的治療或預(yù)防效果。一般,肽模擬物與范例多 肽(即具有生物學(xué)或藥理學(xué)活性的多肽)結(jié)構(gòu)相似(例如在目的多肽中發(fā)現(xiàn)的),但一 個或多個肽鍵任選地替代為選自例如-CH2NH-,-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH = CH-(順式和反 式),-C0CH2-,-CH(OH) CH2-,和-CH2S0-的連接。模擬物可以完全由合成的非天然氨基酸 類似物構(gòu)成,或可以是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。模擬物 也可以并入任何數(shù)量的天然氨基酸保守替代,只要該保守替代也不實質(zhì)性改變模擬物的結(jié) 構(gòu)和/或活性即可。例如,如果模擬物組合物能夠具有ANGPTL3多肽的軟骨發(fā)生活性,則該 模擬物組合物落入本發(fā)明范圍內(nèi)。
      [0034] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用,指氨基酸殘基的聚合物。該 術(shù)語適用于其中的一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸 聚合物、以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。本發(fā)明多肽、肽和蛋白質(zhì)包括具有 軟骨發(fā)生活性的蛋白酶抗性ANGPTL3肽模擬物。
      [0035] 術(shù)語"氨基酸"指天然的和合成的氨基酸、以及以類似于天然氨基酸的方式發(fā)揮 功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸、以及之后 修飾的氨基酸,例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和〇-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指,與天然 氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)一一即與氫、羧基基團、氨基基團和R基團結(jié)合的碳一一 的化合物,例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。此類類似物具有修飾的R基團(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架,但保持與天 然氨基酸一樣的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。天然編碼的氨基酸為20種常見氨基酸(丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸)以及吡咯賴 氨酸(pyrrolysine)、P比略啉-羧基-賴氨酸(pyrroline-carboxy-lysine)、和硒代半胱氨 酉愛(selenocysteine) 〇
      [0036] "保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。對于特定核酸序列,保守修飾的 變體指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸,或在該核酸不編碼氨基酸序列的情況 下,指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性,任何給定的蛋白質(zhì)均可以由多個功能相同 的核酸編碼。例如,密碼子GCA,GCC,GCG和G⑶均編碼氨基酸丙氨酸。因此,在每一個由密 碼子規(guī)定丙氨酸的位置上,該密碼子均可以被改變?yōu)槿我凰龅南鄳?yīng)密碼子而不改變編碼 的多肽。該核酸變異是"沉默變異",其是保守修飾變異中的一種。本文中每一個由多核苷 酸編碼的多肽序列都涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了,核酸中 的每一個密碼子(除了 AUG-一通常是甲硫氨酸的唯一密碼子,和TGG-一通常是色氨酸的 唯一密碼子)均可以被修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此,本文描述的每一個序列都隱含 了編碼多肽的核酸的每一種沉默變異。
      [0037] 本領(lǐng)域技術(shù)人員明了,對于核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列上的各替代、缺失或添加, 當(dāng)其導(dǎo)致相對于原始編碼的氨基酸序列而言改變、添加或缺失了單個氨基酸或小百分數(shù) 的氨基酸,如果該改變造成氨基酸被化學(xué)相似的氨基酸替代、和/或造成可以產(chǎn)生與原始 蛋白質(zhì)具有相似功能活性的結(jié)構(gòu)相似蛋白質(zhì)的多肽序列時,則該改變導(dǎo)致"保守修飾的變 體"。本領(lǐng)域熟知提供功能相似氨基酸的保守替代表。此類保守修飾變體與本發(fā)明的多態(tài) 性變體、物種間同源物和等位基因一起涵蓋在本發(fā)明中,且不排斥本發(fā)明的多態(tài)性變體、物 種間同源物和等位基因。
      [0038] 術(shù)語"保守氨基酸替代"指,來自一個保守氨基酸替代組的氨基酸(概念地或以其 它方式)替代為來自相同組的不同氨基酸。替代的一個例子基于分析同源生物的相應(yīng)蛋白 質(zhì)之間氨基酸變化的標化頻率(參見例如Schulz, G.E.和R.H.Schirme
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