一種美容作用的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥或者醫(yī)藥美容技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的藥 物。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸鈉是人和動物皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)潤滑液和軟骨組織的重要成分，它由 (I-P-4)D-葡糖醛酸和（I-P-3)N-乙?；?D-氨基葡糖雙糖單位重復(fù)連接而成，由于透 明質(zhì)酸直鏈軸上單糖之間氫鍵的作用，透明質(zhì)酸分子在空間上呈剛性的螺旋柱狀結(jié)構(gòu)，柱 的內(nèi)側(cè)由于存在大量的羥基而產(chǎn)生強(qiáng)親水性，而且透明質(zhì)酸分子將其結(jié)合的水分子鎖定在 其雙螺旋柱狀結(jié)構(gòu)中，使水分不易流失，因此具有特殊的保水作用，保水能力理論上可高達(dá) 500ml/g，被譽(yù)為理想的天然保濕因子。隨著年齡增長，體內(nèi)HA的減少，口服含有透明質(zhì)酸 的保健品可補(bǔ)充體內(nèi)HA，具有延緩衰老和潤澤皮膚等功效，在日本、美國等國家已被廣泛使 用。透明質(zhì)酸具有良好的理化性能及生物相容性。然而，它在體內(nèi)受到透明質(zhì)酸酶的酶解 作用而迅速降解，存留時間較短，需要重復(fù)注射才能達(dá)到療效。交聯(lián)透明質(zhì)酸是透明質(zhì)酸鈉 經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)修飾得到的具有三維立體結(jié)構(gòu)的高分子凝膠，可以彌補(bǔ)透明質(zhì)酸鈉存留時間 短等缺點(diǎn)，同時仍具有良好的生物相容性及效果。
[0003] 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的常規(guī)制備方法是將透明質(zhì)酸鈉與交聯(lián)劑在堿性溶液中攪 拌混合，通過交聯(lián)劑使透明質(zhì)酸高分子鏈間化學(xué)鍵合來制備。但是所用的交聯(lián)劑殘留在 生物體內(nèi)容易引發(fā)炎癥反應(yīng)。去除凝膠產(chǎn)物中的交聯(lián)劑目前也是一個大問題，最常用去 除或降低交聯(lián)劑殘留量的方法包括透析法或以水或緩沖溶液清洗，但此類方法都無法有 效的去除或降低交聯(lián)劑含量，且周期長，不易實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。另有一種，如果是制備交聯(lián) 的透明質(zhì)酸固態(tài)物，常用去除交聯(lián)劑的方法是沉淀法，用有機(jī)溶劑清洗使交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉 凝膠沉淀，但此方法仍無法完全除去殘留的自由交聯(lián)劑。國內(nèi)很多專利（CN101759881、 CN101502677、CN1590444、CN102558600等）都是使用透明質(zhì)酸鈉與交聯(lián)劑1，4_ 丁二醇二 縮水甘油醚（以下簡稱BDDE)在堿性溶液中反應(yīng)制得的凝膠，其中專利CN101759881公開 了BDDE交聯(lián)HA制備醫(yī)用交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠衍生產(chǎn)品，雖然制備的凝膠體內(nèi)存留時間長、 生物相溶性好，但是去除交聯(lián)劑的周期長、很難完全去除或降低交聯(lián)劑的殘留量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于上述原因，申請人在通過研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過BDDE交聯(lián)制備得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸 鈉，采用加水后加入L-天門冬氨酸后，乙醇沉淀后得到純化的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉，純化后的 交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉制備成凝膠劑質(zhì)量更加優(yōu)秀，該凝膠劑中BDDE含量小于0. 5yg/g，其中蛋 白質(zhì)質(zhì)量百分含量小于〇. 1%。申請人對交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠劑進(jìn)行研究，得到一種新的凝 膠劑，該凝膠劑中PH調(diào)節(jié)劑采用透明質(zhì)酸，穩(wěn)定性試驗研究表明，采用透明質(zhì)酸作為pH調(diào) 節(jié)劑的凝膠劑具有更好的穩(wěn)定性。
[0005]本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0006] 一種美容作用的藥物，該藥物由交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉、生理鹽水和pH調(diào)節(jié)劑制備而 成。
[0007] 優(yōu)選美容作用的藥物，其中交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉15-25重量份，生理鹽水975-985重量 份。
[0008] 上述所述的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉是透明質(zhì)酸鈉經(jīng)過BDDE交聯(lián)制備得到的。
[0009] 上述所述的藥物中BDDE含量大于零小于0. 5yg/g。
[0010] 上述所述的藥物中蛋白質(zhì)質(zhì)量百分含量小于0. 1%。
[0011] 上述所述的pH調(diào)節(jié)劑為透明質(zhì)酸，交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉與透明質(zhì)酸的重量比為 3-5 ： 1〇
[0012] 上述所述藥物為凝膠劑。
[0013] 上述所述的凝膠劑的制備方法為：
[0014] ⑴交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉純化
[0015] 取交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉，加入注射用水，加熱至35°C-45°C，加入交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉重量 0. 35-0. 45倍的L-天門冬氨酸，攪拌均勻，加入交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉重量的7. 5-9倍的無水乙 醇，降溫至5°C-KTC，保留沉淀，冷凍干燥，得到純化后的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉；
[0016] (2)制劑制備
[0017] 取純化后的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉，加入生理鹽水，加入透明質(zhì)酸混合均勻，過100目篩 網(wǎng)，12rc濕熱滅菌30分鐘，灌裝，即得。
[0018] 本發(fā)明所述的交聯(lián)劑BDDE為：1，4- 丁二醇二縮水甘油醚。
[0019] 上述所述的透明質(zhì)酸鈉（CAS號：9067-32-7)來自細(xì)菌發(fā)酵而得；交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉 以透明質(zhì)酸鈉為原料，經(jīng)過BDDE交聯(lián)制備得到；透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸鈉以及交聯(lián)透明質(zhì)酸 鈉由臺灣和康生物科技股份有限公司提供。
[0020] 或者由下述方法制備：取透明質(zhì)酸加入0.IN氫氧化鈉溶液中（pH= 12. 5)，取交 聯(lián)劑BDDE(1，4 丁二醇縮水甘油醚）加入95%乙醇溶液，加入透明質(zhì)酸堿溶液中，在30°C的 環(huán)境下進(jìn)行20小時交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)后破碎后，以50%乙醇清洗，再用水洗，濃縮，冷凍干燥， 得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉。
[0021] 其他原料由北京美迪康信醫(yī)藥科技有限公司提供。
[0022] 下述試驗是在多次創(chuàng)造性試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)本發(fā)明所保護(hù)的技術(shù)方案進(jìn)行的結(jié)論 性試驗。
[0023] 一、純化方法研究
[0024] 試驗方法1 :交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉純化：取交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉10g，加入注射用水1L，加熱 至40°C，加入4g的L-天門冬氨酸，攪拌均勾，加入80g無水乙醇，降溫至8°C，保留沉淀，冷 凍干燥，得到純化后的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉9. 3g;
[0025] 取純化后的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉2g，加入生理鹽水98g，加入0. 5g透明質(zhì)酸混合均勻， 過100目篩網(wǎng)，121°C濕熱滅菌30分鐘，灌裝，即得100支。
[0026] 試驗方法2 :配制1 %的氫氧化鈉水溶液20ml，加入交聯(lián)劑BDDEO. 2g，混合均勻后， 加入2.Og透明質(zhì)酸鈉，攪拌均勻后，放入4°C冰箱靜置48h。然后，再放入40°C水浴鍋，加 熱2h后，取出切成質(zhì)量Ig的凝膠，放入PBS緩沖液中，膨脹透析8h，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝 膠，濃度為20mg/ml。
[0027] 試驗方法3 :取5.Oml濃度為0. 5M的氫氧化鈉水溶液和50yL交聯(lián)劑1，4- 丁二 醇二縮水甘油醚，兩者混合均勻，在磁力攪拌下加入透明質(zhì)酸鈉〇. 9g，攪拌5分鐘后置于可 控制溫度的恒溫水浴箱中50°C反應(yīng)Ih后，再在20°C下反應(yīng)3天，反應(yīng)結(jié)束后，所得反應(yīng)物 中加IOOmLpH為7. 0的0.IM磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)浸泡清洗，以使得到pH< 7. 5和生理上 可接受的滲透壓值，瀝干水分，收集凝膠，通過150目的篩網(wǎng)，然后滅菌，即可得到交聯(lián)透明 質(zhì)酸鈉凝膠產(chǎn)物。
[0028] 試驗方法4 :交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉純化：取交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉10g，加入注射用水1L，加熱 至40°C，加入4. 3g的L-谷氨酸，攪拌均勻，加入80g無水乙醇，降溫至8°C，保留沉淀，冷凍 干燥，得到純化后的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉9. 3g;
[0029] 取純化后的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉2g，加入生理鹽水98g，加入0. 5g透明質(zhì)酸混合均 勻，過100目篩網(wǎng)，121°C濕熱滅菌30分鐘，灌裝，即得100支。
[0030] 試驗方法：取上述不同試驗方法凝膠，按照下述方法，檢測凝膠中BDDE含量以及 蛋白質(zhì)含量，試驗結(jié)果見表1。
[0031] 檢驗方法：
[0032] 蛋白質(zhì)含量分析：
[0033] 1原理
[0034] 福林酚試液能夠與溶液中的蛋白質(zhì)發(fā)生有色反應(yīng)，且其顏色深淺與蛋白質(zhì)的濃度 成正比。
[0035] 2設(shè)備
[0036] 分析天平、紫外分光光度計或相當(dāng)設(shè)備、旋渦式混合器或相當(dāng)設(shè)備。
[0037] 3溶液制備
[0038] 3. 1試劑A:稱取I.Og水合硫酸銅（CuSO4 ? 5H20)，加水溶解并稀釋至100mL。
[0039] 3. 2試劑B:稱取2.Og水合酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6 ? 4H20)，加水溶解并稀釋至 IOOmL0
[0040] 3. 3試劑C:稱取25.Og無水碳酸鈉及5.Og氫氧化鈉，加水溶解后稀釋至250mL。
[0041] 3. 4試劑D:臨用前，將等量的試劑A及試劑B混合。
[0042] 3. 5試劑E:臨用前，將1份試劑D及10份試劑C混合。
[0043] 3. 6試劑F:臨用前，取福林酚試液（Folin-酚試液）進(jìn)行10倍稀釋。
[0044] 注：試驗所用試劑均為分析純。
[0045] 4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0046] 4. 1精密稱取經(jīng)五氧化二磷真空干燥的牛血清白蛋白對照品約50mg，加水溶解并 稀釋至 250ml，（約 200yg/ml)。
[0047] 4. 2 精密移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液I.Oml，2.Oml，4.Oml，5.Oml，10.Oml，稀釋至100mL(濃 度約為 2yg/ml，4yg/ml，8yg/ml，10yg/ml，20yg/ml)。
[0048] 5 步驟
[0049] 5.I取2ml供試品置入組織勻漿器內(nèi)，往復(fù)勻力施壓，是其進(jìn)入球部，吸管吸出球 部內(nèi)容物即為前處理樣品。經(jīng)過前處理的樣品均質(zhì)、清透、仍保有粘彈性，具有較好的流通 性，方便取樣器對樣品的抽取和稀釋。
[0050] 5. 2精密移取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液I. 0ml，空白管精密移取蒸餾水I. 0ml，樣品管精密 稱取樣品I. 〇g。按式（1)計算樣品管中透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量，以微克表示。
[0051] 按式（1)計算樣品管中透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量，以微克表示。
[0052] 式中：
[0053] m-透明質(zhì)酸鈉凝膠質(zhì)量，單位為克（g);
[0054]c-透明質(zhì)酸鈉標(biāo)示質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升（mg/ml);
[0055] d-透明質(zhì)酸鈉凝膠密度為I. 01g/ml;
[0056] 5. 3于上述各管中加入試劑El. 0ml，經(jīng)旋渦振蕩器混合，室溫放置lOmin。加入 3.Oml試劑F，經(jīng)旋禍混合器混勾后，在50°C水浴放置lOmin，于750nm處測定吸光度。
[0057] 6結(jié)果計算
[0058] 用直線回歸法計算結(jié)果，計算公式按（B. 2)約計算透明質(zhì)酸鈉蛋白質(zhì)含量P3(質(zhì) 量分?jǐn)?shù)）：
[0059]
[0060] 式中：
[0061] P「樣品管中透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量，單位為微克（yg);
[0062] P2-樣品管中蛋白質(zhì)質(zhì)量，單位為微克（yg)。
[0063] BDDE殘留量測定：
[0064] 1檢測原理
[0065]l，4_butanedioldiglycidyletherG3DDE)中的環(huán)氧化物在喊性及苯乙酮環(huán)境 下，會與Nicotinamide(煙酰胺/尼克酰胺）發(fā)生定量的親核取代反應(yīng)，并于酸性條件下生 成強(qiáng)焚光物質(zhì)（Xex= 370nm/Aem= 430nm)，且焚光強(qiáng)度與其含量成正比。因而通過檢測 產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度可測定交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠中的BDDE殘留量。
[0066] 2主要實驗儀器和試藥 [0067]儀器
[0068]-熒光分光亮度計[0069]-微量天平
[0070] -恒溫水槽
[0071]試劑
[0072]
[0073] 3試劑配制
[0074]2.Omg/mLBDDE標(biāo)準(zhǔn)品儲存液：
[0075] 取IOOmgBDDE置50ml容量瓶中，加PBS定容至50ml后混勻，備用。
[0076]125mmole/L尼克酉先