一種蛇床子提取物及其抗腫瘤用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及一種蛇床子提取物及含有該提取物的藥物制劑， 該蛇床子提取物可以用來制備治療黑色素瘤的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物蛇床子為一年生草本植物，高30~80cm。莖直立，有分枝，表面有縱溝紋，疏 生細柔毛。葉互生，2~3回羽頭細裂，最終裂片線狀披針形，先端尖銳；基生葉有長柄，柄 基部擴大成鞘狀。復(fù)傘形花序頂生或腋生；總苞片8~10,線形；花白色，花柱基短圓錐形， 花柱細長，反折。雙懸果寬橢圓形，果棱具翅?；ㄆ?~7月，果期6~8月。生于原野、田 間、路旁、溪溝邊等潮濕處。
[0003] 中藥蛇床子為傘形科（Umbelliferae)蛇床屬植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實。蛇床子性溫，味辛苦，有小毒。外用燥濕殺蟲止癢，內(nèi)服溫腎壯陽， 祛風(fēng)燥濕。用于治療陽痿，宮冷，寒痹腰痛，外治滴蟲性陰道炎，手、足癬感染等。國內(nèi)外關(guān) 于蛇床子藥理效應(yīng)的報道很多，涉及免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管、呼吸及生殖等系統(tǒng)，主要 表現(xiàn)為抗炎、抗過敏、中樞抑制、抗心律失常及抗腫瘤等作用。
[0004] 蛇床子主要含香豆素類化合物，此外還有色原酮類和苯并呋喃類化合物。蛇床子 揮發(fā)油中，相對含量較高的組分主要有倍半萜類，此外還有酯類和萜醇類化合物。大量研究 證明蛇床子的有效成分為香豆素類化合物，其中含量最高的兩種香豆素類化合物為蛇床子 素（0sthole，0st)、歐前胡素（Imperatorin，Imp)。因此Ost及Imp經(jīng)常作為評價不同來源 地的蛇床子藥材的質(zhì)量及含蛇床子中成藥的質(zhì)控指標。由于Ost具有許多重要的藥理活性 包括抗癌、抗增殖等活性，以及Imp具有抑制癲癇發(fā)作、擴張血管、抑制心肌肥大、抑制腫瘤 細胞增殖、抗微生物、影響藥物代謝酶活性等多種藥理作用，而受到越來越多的關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種蛇床子提取物，該提取物的制備方法和液相分析方 法，含有該提取物的藥物制劑及利用該提取物制備治療黑色素瘤藥物的用途。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0007]-種蛇床子提取物，該提取物由以下方法制備：
[0008] 步驟一：蛇床子藥材粉碎，水蒸汽蒸透，烘干；
[0009] 步驟二：用75%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味；
[0010] 步驟三：對步驟二濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得 到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；
[0011] 步驟四：正丁醇萃取物用AB-8大孔樹脂富集，先用10%乙醇沖洗8個柱體積除去 多糖，再用65%乙醇洗脫6個柱體積，收集65%洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥。
[0012] 進一步地，步驟一中蒸制方法為：高壓滅菌鍋105°C蒸制2小時。
[0013] 為了能夠通過建立HPLC指紋圖譜的方法控制不同產(chǎn)地、批次藥材制備的蛇床子 提取物批間差異，所述提取物的液相分析方法為：
[0014] 色譜柱：DiamonsilC18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);
[0015] 流動相：A為乙腈，B為0.I%磷酸溶液（三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6. 5);
[0016] 梯度洗脫程序：0. 01 ~70min，A20% - 80% ;流動相流速：1.OmL?minS
[0017] 檢測波長：240nm;柱溫：30°C;進樣量10yL。
[0018] 藥物制劑，含有治療有效量的所述蛇床子提取物和藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 所述的蛇床子提取物在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0020] 所述的藥物制劑在制備治療黑色素瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明提取物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物制劑的形式使用。
[0022] 所述藥物制劑含有治療有效量的本發(fā)明蛇床子提取物，其余為藥物學(xué)上可接受 的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0023] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物制劑以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明提取物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0024] 本發(fā)明的優(yōu)點：本發(fā)明通過對蛇床子藥材蒸制處理，生成更多小極性的化合物，增 強細胞膜通透性，具有抑制黑色素瘤細胞的作用；本發(fā)明提供的液相分析方法可以用于建 立該提取物的指紋圖譜，用于控制不同產(chǎn)地、批次藥材制備的提取物的批間差異。
【附圖說明】 圖1為蛇床子提取物HPLC液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0026] 主要試劑和材料：蛇床子藥材購自安徽亳州中藥材市場；食品級乙醇購自上海 凌峰化學(xué)試劑有限公司；醫(yī)藥級AB-8大孔樹脂購自天津波鴻樹脂有限公司；乙腈為HPLC 級，購于TEDIA;85 %磷酸為HPLC級，購于TEDIA;色譜用純凈水為哇哈哈純凈水。人 A375黑色素瘤細胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)贈。DMEM培養(yǎng)基、0. 25%胰酶購自美國Gibco公司； MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽；四甲基偶氮唑藍、DMSO(二甲基亞 砜）、BrdU購自美國Sigma公司；鼠抗BrdU多克隆抗體購自美國ABcam公司；山羊抗鼠 二抗購自美國Cellsignaling公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國 Promega公司。
[0027] 恒溫CO2培養(yǎng)箱，普通冰箱，-80 °C冰箱均為美國Forma公司；超凈工作臺購自 中國蘇州凈化工程公司；倒置顯微鏡，倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司；電熱恒溫培養(yǎng) 箱購自中國上海躍進醫(yī)療器械廠；自動酶標儀購自日本W(wǎng)ako公司；紫外分光光度儀購自 美國Beckman公司；J6-HC高速離心機購自美國Beckman公司；低溫微量離心機購自德國 Eppendorf公司；振蕩搖床購自美國Forma公司。
[0028] 實施例1 :蛇床子提取物制備
[0029]取蛇床子藥材5kg粉碎，用紗布包裹，置于高壓滅菌鍋中蒸制2小時，溫度105°C， 取出置烘干箱中烘干；烘干藥材用75%乙醇熱回流提取三次，每次提取2小時，每次用75% 乙醇15L，合并提取液，濃縮至無醇味（3L);濃縮液依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯 (3LX3次）和水飽和的正丁醇（3LX3次）萃取，分別得至IJ石油謎萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔樹脂富集，先用10%乙醇沖洗8個柱體積除去 多糖，再用65%乙醇洗脫6個柱體積，收集65 %洗脫液，減壓濃縮，噴霧干燥（545g)。
[0030] 實施例2 :液相色譜分析
[0031] 供試品溶液配制：取實施例1方法制得的提取物5mg至50ml棕色容量瓶中，加 30ml20%乙腈水溶液超聲溶解，冷卻至室溫后，繼續(xù)加20%乙腈水溶液定容。
[0032] 分析方法：
[0033] 高效液相色譜儀：Agilent1260,二元栗；
[0034] 色譜柱：DiamonsilC18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);
[0035] 流動相：A為乙腈，B為0.I%磷酸溶液（三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6. 5);
[0036] 梯度洗脫程序：0? 01 ~70min，A20% - 80% ;流動相流速：1.OmL?minS
[0037] 檢測波長：240nm;柱溫：30°C;進樣量10yL。
[0038] 對用10批不同產(chǎn)地、批次蛇床子制備的提取物進行分析，建立指紋圖譜進行匹 配，結(jié)果1~9號峰在10批樣品色譜圖中均出現(xiàn)。因此標定9個峰為共有指紋峰，據(jù)此建 立該提取物的HPLC指紋圖譜，結(jié)果見圖1。
[0039] 實施例3 :蛇床子提取物藥理試驗
[0040] 一、試驗方法
[0041] 1、細胞培養(yǎng)
[0042] I. 1細胞復(fù)蘇
[0043] 將凍存在液氮罐中的A375黑色素瘤細胞取出，迅速放入37°C的溫水中，輕輕搖動 使其盡快融化（大約lmin)。然后吸出細胞懸液，加入到已加有2mL培養(yǎng)基的離心管中，輕 輕吹打混勻，800r/min，離心5min，棄去上層培養(yǎng)基。用含有10 %FBS和1 %的青霉G/鏈霉 素的DMEM培養(yǎng)基8mL制成細胞懸液后，接種至IOcm培養(yǎng)盤中。然后置于5 %C02、37°C恒 溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0044] 1. 2細胞傳代
[0045] 顯微鏡下觀察細胞融合度達80% -90%時即可進行傳代。先用2mLPBS洗滌細胞2 次，然后加入0. 25%的胰酶lmL。輕輕水平搖動培養(yǎng)盤，使消化液能覆蓋細胞的表面，然后 置于37°C溫箱中消化約lmin。置于顯微鏡下見細胞變圓回縮，然后迅速加入ImL含有FBS 的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打至細胞分散均勻，然后根據(jù)細胞密度按照1:2或1:3傳代，重 新接種于新的培養(yǎng)盤，于5%C02、37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)