一種同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白在制備治療或預(yù)防ev71感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗病毒藥物領(lǐng)域，涉及同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白 (homocysteine-induced endoplasmic reticulum protein, HERP)(GenBank accession no. NM_001010989)的新用途，更具體涉及一種同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白在制備治療 或預(yù)防腸道病毒71型（EV71)病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71)屬于小核糖核酸（小RNA)病毒科 (Picornaradae)腸道病毒屬（Enterovirus)，是一個(gè)正鏈的單鏈RNA病毒。EV71是引起嬰 幼兒手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD)最主要的病原體之一，嚴(yán)重的EV71 感染還能引起一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，比如腦干腦炎、無菌性腦膜炎和急性弛緩性癱瘓等。自 1969年EV71首次被發(fā)現(xiàn)并于1974年首次分離獲得，EV71已在世界各地嬰幼兒中引起了大 規(guī)模的手足口病暴發(fā)流行，包括美國、歐洲和亞太地區(qū)都出現(xiàn)過EV71疫情的暴發(fā)，中國臺 灣從1998年開始就出現(xiàn)了 EV71疫情。而其因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致的并發(fā)癥和隨之而來的 高死亡率，引起了世界各國的高度警惕和關(guān)注。最近幾年EV71感染在中國暴發(fā)頻繁，對人 體健康和公共安全都造成了巨大的威脅。
[0003] 在中國暴發(fā)流行的EV71病毒導(dǎo)致的手足口病主要是EV71病毒的C4亞型，并且存 在EV71和柯薩奇病毒（CVA16)的混合感染和周期性暴發(fā)。雖然在中國引起暴發(fā)的病毒致死 率并不高，但是其高暴發(fā)率仍然需要警惕。而且，迄今為止仍然沒有針對EV71病毒開發(fā)的 安全有效的抗病毒感染藥物或者疫苗獲準(zhǔn)上市。除了天然產(chǎn)品或者化合物以外，針對EV71 病毒的復(fù)制特點(diǎn)和生活周期，開發(fā)藥物主要有以下策略和分子靶標(biāo)。
[0004] 中和抗體：EV71病毒的單克隆抗體，通過EV71病毒的類病毒顆粒感染小鼠，獲得 病毒的單克隆抗體，能特異性地與EV71病毒結(jié)合，改變病毒的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)病毒基因組的釋 放，從而阻斷病毒對宿主細(xì)胞的感染。
[0005] 針對病毒入侵：阻止病毒入侵細(xì)胞是抗病毒的一個(gè)有效策略。一些藥物在感染細(xì) 胞之前與EV71病毒顆粒共同孵育，通過結(jié)合EV71病毒的衣殼結(jié)構(gòu)，阻止病毒與細(xì)胞受體之 間的結(jié)合，能明顯降低病毒的入侵和子代病毒的產(chǎn)生。這些藥物能夠結(jié)合EV71病毒顆粒， 通過阻止病毒結(jié)合配體、阻斷入侵、抑制EV71病毒脫殼等，通過結(jié)合衣殼蛋白上的特定結(jié) 構(gòu)來進(jìn)行開發(fā)。
[0006] 針對病毒蛋白：EV71病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1，非結(jié)構(gòu)蛋白2A和3C在病毒的結(jié)合和復(fù) 制過程中都有重要的作用，因此一些特異性的小分子藥物被開發(fā)出來，這些藥物能特異性 的結(jié)合病毒蛋白（如VP1)，或者抑制非結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白酶活性（如2A和3C)。
[0007] 針對病毒復(fù)制復(fù)合體：病毒的復(fù)制需要依賴3D聚合酶組成的RdRP復(fù)制復(fù)合體，因 此，抑制了 3D聚合酶的復(fù)制活性，也就達(dá)到了抑制病毒基因組復(fù)制的目的，從而阻斷病毒 的感染進(jìn)程。
[0008] 針對病毒翻譯：由于EV71病毒的基因組RNA沒有5'端帽子結(jié)構(gòu)，其復(fù)制依賴于 IRES元件，并收到ITAFs的調(diào)控，而據(jù)報(bào)道，F(xiàn)BP2蛋白能夠競爭性的結(jié)合ITAFs中的PTB， 從而抑制IRES活性，從而實(shí)現(xiàn)抑制EV71病毒的復(fù)制和翻譯的效果。
[0009] 此外，還有其他一些方式可能能夠抑制EV71病毒的復(fù)制，比如RNA干擾、調(diào)節(jié)宿主 的免疫系統(tǒng)和運(yùn)用干擾素治療等。
[0010] HERP 蛋白又被稱作 SUP (Stress-associated Ubiquitin-like Protein)， Mifl(methyl methanesulphonate(MMS)_inducible fragmentl)或 HERPUD1，編碼 39I 個(gè) 氨基酸。HERP蛋白的表達(dá)受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控HERP中有多種 順式元件和調(diào)控因子參與，能被同型半胱氨酸引起的未折疊蛋白反應(yīng)激活，并且由于其 定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，因此被稱為同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（homocysteine-induced endoplasmic reticulum protein, HERP)。在衣霉素處理、滲透壓休克和紫外線照射下，同 樣會促進(jìn)其表達(dá)。
[0011] HERP是一個(gè)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的泛素樣膜蛋白，HERP蛋白編碼391個(gè)氨基酸，在其 N末端具有一個(gè)泛素化類似的結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like domain, UBL domain)，包含N末端 的1-87位氨基酸，并且具有泛素化功能。HERP的240-391位氨基酸則構(gòu)成C端，其中包含 跨膜區(qū)域，使ffiRP蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，其N末端和C末端均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞質(zhì)面。
[0012] HERP的功能包括參與蛋白質(zhì)降解、維持Ca2+體內(nèi)平衡，并與某些疾病相關(guān)。幾乎 所有的人體組織中都能檢測到HERP蛋白的存在。HERP蛋白能被未折置蛋白反應(yīng)等引起的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)上調(diào)，并參與保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。目前的研究發(fā)現(xiàn)HERP是泛素家族 的一員，它的功能之一是運(yùn)送內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解（ERAD)底物，將泛素化底物運(yùn)輸?shù)?26S蛋白酶體中降解。
[0013] 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中，HERP蛋白還能幫助細(xì)胞維持Ca2+體內(nèi)平衡。在神經(jīng)細(xì)胞中， JERP能受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡時(shí)，JERP能穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 Ca2+水平、保護(hù)線粒體功能和抑制caspase3的活性，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，從而提高細(xì)胞的生 存能力，避免發(fā)生細(xì)胞凋亡。
[0014] 在帕金斯病人黑質(zhì)和路易小體中，HERP的表達(dá)量明顯升高，提示其在神經(jīng)退化及 神經(jīng)炎癥中的作用，在帕金斯癥中HERP能依賴泛素-蛋白酶體降解途徑維持Ca 2+平衡和防 止細(xì)胞凋亡。而在二型酒精中毒患者中，受到酒精毒性影響，JERP的mRNA水平在神經(jīng)保護(hù) 細(xì)胞中也明顯上升。系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的相關(guān)研究表明，JERP也有抗脫氧核糖核酸反應(yīng)的 能力。但是，目前還沒有HERP與病毒性疾病及相關(guān)病毒之間關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，也沒有HERP 對現(xiàn)在較為流行且致病力較強(qiáng)的腸道病毒71型（EV71)的預(yù)防與治療作用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（HERP)在制備 治療或預(yù)防腸道病毒71型（EV71)藥物中的應(yīng)用。從細(xì)胞和分子層面對同型半胱氨酸誘導(dǎo) 的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（HERP)抗EV71病毒作用進(jìn)行了評價(jià)，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了良好的基 礎(chǔ)。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0016] -種同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白在制備治療或預(yù)防EV71感染藥物中的應(yīng) 用，其步驟是：
[0017] A、利用pCMV_Tag_Flag2B載體（哺乳動物表達(dá)載體，Agilent Technologies)構(gòu) 建pCMV-HERP質(zhì)粒。
[0018] B、在對EV71病毒敏感的人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞（rhabdomyosarcoma，RD細(xì) 胞，中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)）（CCTCC)獲得）中過表達(dá)了構(gòu)建的pCMV-HERP表 達(dá)質(zhì)粒，24小時(shí)后用一定量的EV71病毒感染。EV71病毒的VPl結(jié)構(gòu)蛋白和3C非結(jié)構(gòu)蛋白 作為EV71病毒復(fù)制的檢測標(biāo)志物，并針對VPl蛋白基因設(shè)計(jì)了熒光定量檢測引物。
[0019] C、時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染空載pCMV-Tag-Flag2B載體和pCMV-HERP質(zhì)粒24小時(shí)后分 別感染EV71病毒4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)后收樣提取總RNA并檢測VPl的mRNA 水平，同時(shí)檢測病毒蛋白水平。
[0020] 上述結(jié)果表明：過表達(dá)HERP蛋白能夠明顯抑制EV71病毒VPl的mRNA水平，并且 隨著HERP質(zhì)粒濃度的提高呈現(xiàn)梯度降低的劑量依賴效應(yīng)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)也顯示了 VPl和 3C蛋白的表達(dá)水平也隨著HERP蛋白表達(dá)量的提高而降低。
[0021] 未感染病毒的對照組沒有明顯區(qū)別，而感染了病毒并過表達(dá)HERP蛋白的實(shí)驗(yàn)組 與空載相比，在不同的時(shí)間點(diǎn)均不同程度的抑制了病毒的復(fù)制。隨后檢測了 VPl和3C蛋白， 并得到了與mRNA水平類似的結(jié)果
[0022] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白新的藥用價(jià)值，為抗腸道病毒71 型、治療和/或預(yù)防EV71感染提供了新的有效藥物。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0024] 本發(fā)明從細(xì)胞和分子層面對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（HERP)抗EV71病毒 作用進(jìn)行了評價(jià)，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。表明該藥物具有開發(fā)成抗EV71 病毒的有效藥物而應(yīng)用于臨床的前景。
【附圖說明】
[0025] 圖1為一種HERP蛋白抑制EV71病毒VPl的mRNA水平（* :p〈0. 5,差異顯著；: p〈0. 05,差異極顯著）不意圖。
[0026] 隨著pCMV-HERP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染濃度的升高，EV71的mRNA水平呈現(xiàn)劑量依賴性的 抑制效果。
[0027] 圖2為一種HERP蛋白抑制EV71病毒VPl和3C蛋白表達(dá)示意圖。
[0028] 隨著pCMV-HERP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染濃度的升高，EV71的VPl蛋白和3C蛋白水平呈現(xiàn) 劑量依賴性的抑制效果。
[0029] 圖3為一種不同時(shí)間梯度的HERP蛋白抑制EV71病毒的mRNA水平（ns.:無顯著 性差異；*:P〈〇.5,差異顯著；** :p〈0. 05,差異極顯著）不意圖。
[0030] 在不同的病毒感染時(shí)間下，隨著pCMV-HERP的過表達(dá)，EV71的mRNA水平呈現(xiàn)明顯 的抑制效果。
[0031] 圖4為一種不同時(shí)間梯度的HERP蛋白抑制EV71病毒的蛋白表達(dá)（h p. i.:感染 后時(shí)間）示意圖。
[0032] 在不同的病毒感染時(shí)間下，隨著pCMV-HERP的過表達(dá)，EV71的VPl蛋白和3C蛋白 水平呈現(xiàn)明顯的抑制效果。