一種電荷修飾乳鐵蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及抗癌藥物制取領域，具體涉及一種電荷修飾乳鐵蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002]宮頸癌，是我國總癌癥發(fā)病率的第四位，女性惡性腫瘤發(fā)病和死亡率的第二位，研究發(fā)現(xiàn)在99.7%左右宮頸癌患者中可檢測到HPV，其中高危型HPV與宮頸癌密切相關。每年全球有超過50萬新發(fā)宮頸癌病例，超過20萬女性死于宮頸癌。中國每年有近10萬宮頸癌新發(fā)病例，占了世界新發(fā)病例總數(shù)的將近20%。宮頸癌是第一個由世界衛(wèi)生組織(WHO)確認的完全由HPV感染所引起的癌癥。HPV屬乳多空病毒科A亞群內(nèi)的一組DNA病毒，為20面體立體的病毒，無包膜，直徑45?55 mm，相對分子質(zhì)量為5X 106。該病毒常存在于人體各部，為嗜上皮性病毒。目前已分出100余種HPV的DNA，其中30多種與宮頸感染和病變有關。根據(jù)其致病力的大小分為高危型和低危型兩種，其中HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、108等12種歸為低危型，主要引起生殖道肛周皮膚和陰道下部的外生性濕疣類病變、扁平濕疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN I )，多呈一過性，可自然逆轉；高危型主要為 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 等 15 種，主要導致CIN I1-1II級病變和宮頸癌的發(fā)生，持續(xù)高危型HPV感染的CIN I級易進展為CIN I1-1II。高危型HPV與CIN III和宮頸癌有關，是導致宮頸癌的主要原因，其中高危型HPV16和18與宮頸癌的發(fā)生相關性最強。
[0003]HPV廣泛存在于自然界，人的皮膚、消化道、呼吸道等都攜帶有HPV。凡是有性生活的女性，都可能通過性接觸感染HPV，有70-80%的女性在一生中至少一次會感染HPV。人類的各種癌癥由于病因復雜，目前科學技術難以有效預防及時發(fā)現(xiàn)，并早期治療，而宮頸癌是目前唯一能夠確定病因是因為感染HPV病毒而發(fā)病，因而是所有癌癥中，唯一能有效預防、及時發(fā)現(xiàn)、并能早期治療的癌癥。國際上以HPV為靶標的宮頸癌疫苗研究為主，部分疫苗已完成I/II期臨床試驗，準備進行更深入的研究，但臨床應用尚有諸多問題，如臨床副作用和對環(huán)境的安全性，HPV病毒的嚴格種屬特異性，無法建立動物模型評價疫苗的免疫效果以及疫苗自身的安全性問題等，影響其研究進程。國內(nèi)HPV疫苗還在起步階段，大部分研究集中于中藥制劑的開發(fā)。但由于檢測手段的限制，HPV的檢測采用的是組織病理學、陰道鏡學或PCR等方法，尚未運用到HC2 (HPV DNA第二代雜交捕獲檢測技術)，且未能對其進行定量研究。
[0004]目前，國際國內(nèi)都傾注了極大的熱情在研發(fā)新型的對多種HPV毒株都具有預防及控制效應的藥物及生物制劑上，但是一直沒有突破性的進展。在國際上能有效預防和控制HPV病毒感染的藥物還相對缺乏，而在治療上由于沒有特效藥因而采用的免疫調(diào)節(jié)藥物由于普遍存在無法有效地預防HPV感染、療效不明確、價格昂貴等方面的缺陷而大大控制了其在臨床上的使用，特別是在低收入的發(fā)展中國家。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的就是提供一種電荷修飾的乳鐵蛋白與卡拉膠組合藥物及其制備方法，其能夠預防和治療女性人乳頭瘤病毒感染，以及預防和治療女性婦科革蘭氏陰性細菌感染。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案進行實施:
一種電荷修飾的乳鐵蛋白與卡拉膠組合藥物，包括0.01重量份的LK蛋白(電荷修飾的乳鐵蛋白)、1.5重量份的卡拉膠、5重量份的卡波姆、50重量份的甘油、0.1重量份的尼泊金乙酯。該組合藥物為凝膠劑、栓劑、敷料中一種。
[0007]—種電荷修飾的乳鐵蛋白與卡拉膠組合藥物的制備方法，包括如下操作步驟:
51:按照配比稱取各原料，將0.5g卡波姆在80°C的水中攪拌至充分溶脹，并加0.15g卡拉膠(砸化卡拉膠)，攪拌至完全溶解，趁熱經(jīng)0.22 μ m膜過濾滅菌，得I號溶液；
52:將0.0lg尼泊金乙酯溶解于水中，再加入5g甘油，經(jīng)0.22 μ m膜過濾滅菌，得2號溶液；
53:將2號溶液在攪拌條件下加至I號溶液中混勻，加入0.8g三乙醇胺，調(diào)pH至5.5，得3號溶液；
54:常溫下低速攪拌將0.0Olg LK蛋白(購自于進口的荷蘭DffM分司或者實施例1中制取得到)溶于適量水中，經(jīng)0.22 μ m膜過濾滅菌，得4號溶液；
55:在一定溫度攪拌下，將4號溶液加入3號溶液中混勻，用已滅菌的三乙醇胺溶液調(diào)pH 至 5.5 ;
56:最后加水至10g攪勻即得組合藥物，組合藥物為凝膠劑。
[0008]該組合藥物可用于預防和治療女性人乳頭瘤病毒感染，以及用于預防和治療女性婦科革蘭氏陰性細菌感染。
[0009]本發(fā)明另一個目的是提供一種電荷修飾的乳鐵蛋白制備方法，其包括如下操作步驟:
B1:將3-羥基-鄰苯二甲酸酐溶于二甲基亞砜配制成飽和HP溶液，將乳鐵蛋白溶于
0.1M磷酸鈉溶液配制成20mg/mL的蛋白溶液；
B2:將飽和HP溶液和20mg/mL的蛋白溶液混勻，調(diào)節(jié)pH至10，25°C靜置lh，采用ρΗ7.4的PBS透析，經(jīng)0.45 μ m膜過濾除菌即得電荷修飾的乳鐵蛋白。
[0010]乳鐵蛋白具有廣譜的抗病毒活性，并且其活性大小與其所帶的負電荷多少密切相關。經(jīng)過高新生物科技修飾后得到的活笥蛋白表面帶有更多的負電荷，這些負電荷(陰離子)與病毒蛋白顆粒上的正電荷(陽離子)相互絡合導致病毒蛋白構象變化而失活。同時，該活性蛋白對陰道正常菌群沒有影響，非常適合在陰道產(chǎn)品中使用。因此，通過活性蛋白表面的負電荷與HPV顆粒上的正電荷相互絡合，從而導致HPV蛋白構象變化而失活，阻止了病毒與宿主細胞的結合。另外，選擇的卡拉膠除了可將失活的HPV吸附、包裹排出體外，本身還具有廣譜的抗病毒活性，并對女性人乳頭瘤病毒具有抑制效果，因此本產(chǎn)品適用于阻斷HPV感染和傳播；用于預防及治療HPV感染引起的宮頸病變、生殖道疣以及治療后的復發(fā)，安全有效預防宮頸癌的發(fā)生。此組合藥物具有HPV感染轉陰率最高，使用方便，安全無副作用等特點。
[0011]具體的說，該組合藥物具有如下特點:
a、此組合藥物相比其它抗HPV感染產(chǎn)品，具有轉陰率最高，療效好這一最大特點。
[0012]b、組合藥物還適用于任何年齡的HPV感染女性，可以反復使用。即可預防宮頸癌又可治療HPV感染，包括慢性宮頸炎、宮頸上皮發(fā)育不良，包括CIN 1、I1、III度等，防治兩用。
[0013]C、廣譜抗HPV感染，不僅對HPV16和HPV18感染有效，對其它型別一樣具有保護作用。
[0014]d、由于修飾的乳鐵蛋白與卡拉膠均具有很強的抗病毒活性，它即可抑制由于HPV16和18的被抑制而導致的其它型別HPV繁殖。
[0015]e、不含任何可能對陰道有刺激性的物質(zhì)。
[0016]f、使用方便，安全無副作用，無疼痛。
【附圖說明】
[0017]圖1為組合藥物的制備流程圖；
圖2為電荷修飾的乳鐵蛋白制備方法；
圖3為S2和LK對假病毒感染的影響的數(shù)據(jù)分析圖。
【具體實施方式】
[0018]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例對本發(fā)明進行具體說明。應當理解