長(zhǎng)壽/防衰老sirt1蛋白的激活劑核纖層蛋白a的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】長(zhǎng)壽/防衰老SIRT1蛋白的激活劑核纖層蛋白A
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[0002]發(fā)明背景
Sirtuin (沉默交配型信息調(diào)節(jié) 2 同源物(silent mating type informat1nregulat1n 2 homolog)),含有NAD+依賴(lài)性蛋白質(zhì)脫乙酰酶和ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的III 類(lèi) HDAC，調(diào)節(jié)各種代謝途徑(Denu, 2005 ；Donmez 和 Guarente, 2010 ；Finkel 等，2009 ；Haigis和 Sinclair, 2010)。
[0003]7種哺乳動(dòng)物的sirtuin中，SIRTl (NAD依賴(lài)性脫乙酰酶sirtuin-Ι)是30年前鑒定的釀酒酵母cerevesiae) Sir2 (沉默信息調(diào)節(jié)因子2)的最接近的同源物(Klar等，1979)。SIRTl丟失引起缺陷型配子發(fā)生、心臟和視網(wǎng)膜異常、基因組不穩(wěn)定、小體型和小鼠存活期縮短(Cheng等，2003 ;McBurney等，2003 ;Wang等，2008);并破壞許多飲食限制的有益作用(Chen等，2005)。雖然在釀酒酵母、秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)和果繩屬{Drosophild)中通過(guò)異位Sir2引起壽命延長(zhǎng)仍有爭(zhēng)議(Burnett等，2011 ；Lombard等，2011 ；Tissenbaum 和 Guarente，2001 ；Viswanathan 和 Guarente，2011 ；Viswanathan等，2005)，但是具有額外拷貝的SIRTl的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示類(lèi)似于飲食限制的表型，并且與健康壽命(healthspan)改善一致(Alcendor 等，2007 ；Banks 等，2008 ；Bordone 等，2007 ；Herranz 等，2010 ；Pf Iuger 等，2008)。
[0004]SIRTl 使包括 KU70、Nbsl、p53、NF- κ B、PPAR γ、PGC-1 α、F0X0 和 SUV39H1 在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)脫乙?；?，并調(diào)節(jié)基因組完整性、炎性反應(yīng)、脂肪形成、線粒體生物發(fā)生和脅迫抗性(Lavu等，2008)。例如，SIRTl催化腫瘤抑制物蛋白ρ53的脫乙酰作用，因此通過(guò)抑制Ρ53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡提高生存(Cheng等，2003)。SIRTl還與PPAR- γ和PGC-1 α直接相互作用，由此調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)(Picard等，2004 ；Rodgers等，2005)。
[0005]另外，SIRTl使Foxo3a脫乙?；酝ㄟ^(guò)Foxo3a靶(例如MnSOD、過(guò)氧化氫酶和Gadd45 α )提高脅迫抗性(Brunet等，2004)。SIRTl在胚胎干細(xì)胞(ESC)中高表達(dá)，但其表達(dá)在分化的細(xì)胞中通過(guò)被miRNA介導(dǎo)的過(guò)程而被降低(Saunders等，2010) JIRTl是通過(guò)調(diào)節(jié)P53細(xì)胞分布和Nanog表達(dá)以保持ESC自我更新所必需的(Han等，2008)。在SIRTl ,和57^77+/小鼠中，ESC的造血分化有缺陷，且造血祖細(xì)胞的數(shù)目和功能下降(Lee等，2011)。當(dāng)在5%氧下培養(yǎng)時(shí)，與野生型細(xì)胞相比，SIRTl ,和SIRTl+Z造血祖細(xì)胞兩者顯示有缺陷的增殖(Mantel 等，2008)。
[0006]SIRTl是物種間最保守的防衰老/促長(zhǎng)壽蛋白之一。SIRTl脫乙酰酶活性的增加賦予模擬人代謝或變性疾病(例如肥胖癥、糖尿病和阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease))的各種小鼠模型許多有益作用。因此，SIRTl激活性化合物可有益于患有各種代謝和衰老相關(guān)變性疾病的人類(lèi)患者。另一方面，發(fā)現(xiàn)SIRTl蛋白在各種人類(lèi)癌癥中增量調(diào)節(jié)，并且抑制SIRTl活性可有助于消除癌干細(xì)胞(Li等，2012)。
[0007]已證實(shí)SIRTl活性增加在許多疾病模型和人類(lèi)患者中是有益的；因此，被廣泛接受的是，SIRTl激活性化合物可為各種代謝和變性疾病提供治療益處(Baur，2010)。另一方面，SIRTl在p53凋亡活性中的抑制作用表明SIRTl的促腫瘤性質(zhì)(Luo等，2001)。實(shí)際上，據(jù)報(bào)道在許多類(lèi)型的瘤形成中，包括前列腺癌、急性髓性白血病、結(jié)腸癌和各種非黑素瘤皮膚癌，SIRTl蛋白升高(Deng，2009)。據(jù)最新報(bào)道，抑制SIRTl激活p53，因此有利于清除白血病干細(xì)胞(Li等，2012)。因此，SIRTl抑制性化合物為各種人惡性腫瘤提供治療潛力。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇，一種在篩選SIRTl激活劑時(shí)鑒定的化合物，延長(zhǎng)酵母、蠕蟲(chóng)和蠅的壽命，并增強(qiáng)嗤齒動(dòng)物的健康壽命(Agarwal 和 Baur，2011 ；Baur 等，2006 ；Howitz 等，2003 ；Milne等，2007 ;Wood等，2004)。已報(bào)道了白藜蘆醇對(duì)衰老相關(guān)性白內(nèi)障、骨密度減少、神經(jīng)退行性疾病、肥胖癥和糖尿病的有益作用。白藜蘆醇誘導(dǎo)多基因表達(dá)改變，模擬了由熱量限制(CR)所誘導(dǎo)的多基因表達(dá)改變(Pearson等，2008)。攝食ResVida? (—種含有白藜蘆醇的組合物)，在胖人個(gè)體中提供類(lèi)似于CR的顯著代謝變化(Timmers等，2011)。有關(guān)另一種含有白藜蘆醇的營(yíng)養(yǎng)品Longevine/的研究顯示，短期攝食該營(yíng)養(yǎng)品會(huì)再現(xiàn)CR的長(zhǎng)期作用(Barger 等，2008)。
[0008]由基因座編碼的A型核核纖層蛋白是V型中間絲蛋白質(zhì)。兩種最著名的A型核纖層蛋白，核纖層蛋白A和C，只在C端不同，其中CaaX基序規(guī)定一系列加工事件，包括短暫的異戊二稀化(Rusinol和Sinensky，2006)。Zyl細(xì)中新生G608G突變促進(jìn)可變剪接，產(chǎn)生部分加工的前核纖層蛋白A (prelamin A)(亦稱(chēng)為progerin)，這是Hutchinson-Gilford早老綜合征(一種嚴(yán)重形式的早發(fā)性早衰)的主要原因(Eriksson等，2003) oZmpste24 (一種負(fù)責(zé)前核纖層蛋白A成熟的金屬蛋白酶)缺陷型小鼠，出現(xiàn)類(lèi)似于Hutchinson-Gilford早老綜合征(HGPS)患者的許多早衰樣特征(progeroid features)(Pendas 等，2002)。
[0009]本發(fā)明人和其它研究者表明，HGPS皮膚成纖維細(xì)胞和來(lái)源于Z尊胚胎的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)經(jīng)歷歸因于基因組不穩(wěn)定和p53途徑過(guò)度活化的早衰，且通過(guò)Z皿7a雜合性降低Z尊小鼠的前核纖層蛋白A水平改善早衰樣表型并且顯著延長(zhǎng)壽命(Fong等，2004 ；Liu等，2005 ；Varela等，2005)。經(jīng)改造以表達(dá)progerin的人細(xì)胞顯示有缺陷的增殖和早衰(Candelar1等，2008 ；Kudlow等，2008)。
[0010]核纖層蛋白Α/C是核基質(zhì)(NM)的主要組分，核基質(zhì)是不同于染色質(zhì)且對(duì)維持核結(jié)構(gòu)是重要的絲狀核骨架(Fey等，1991)。染色質(zhì)和其它蛋白質(zhì)與匪動(dòng)態(tài)相關(guān)以調(diào)節(jié)各種核活動(dòng)，包括復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和染色質(zhì)組構(gòu)(Blencowe等，1994 ;Kruhlak等，2000 ；Phair和Misteli，2000)。例如，NM與大多數(shù)核組蛋白脫乙酰酶(HDAC)活性共純化(Downes等，2000 ；Hendzel等，1991 ；Li等，1996)。HGPS和Z尊細(xì)胞的標(biāo)志之一是畸形核，這導(dǎo)致無(wú)序的異染色質(zhì)(Liu等，2005 ;Pendas等，2002 ;Scaffidi和Misteli，2005)和錯(cuò)定位的核蛋白質(zhì)，例如 ATR、SKIP、XPA 和 Mof (Krishnan 等，2011 ;Liu 等，2005 ;Liu 等，2008 ；Manju 等，2006 ;Pendas 等，2002 ;Scaffidi 和 Misteli，2005，2006，2008)。通過(guò)經(jīng)由用法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)處理降低來(lái)自核被膜的未加工的前核纖層蛋白A或progerin以挽救核形狀異常顯著改善HGPS細(xì)胞和小鼠模型兩者中的早衰樣特征(Capell等，2005 ；Fong等，2006 ；Glynn 和 Glover, 2005 ；Toth 等，2005 ；VareIa 等，2008)。
[0011]野生型Zyl細(xì)基因座上的可變剪接事件可導(dǎo)致低水平progerin的表達(dá)，這可影響正常的老化過(guò)程(Scaffidi和Misteli，2006)。發(fā)現(xiàn)在正常的個(gè)體中，在老化期間表達(dá)progerin的細(xì)胞數(shù)增加(McClintock等，2007)，且端?？s短或功能障礙激活progerin產(chǎn)生(Cao等，2011)。這些研究結(jié)果表明progerin可能通過(guò)調(diào)節(jié)參與老化的蛋白質(zhì)的活性，促進(jìn)正常的老化過(guò)程(Burtner和Kennedy，2010)。
[0012]在過(guò)去幾年內(nèi)，白藜蘆醇和SIRTl蛋白的熱量限制(CR)模擬性質(zhì)在尋找白藜蘆醇模擬物和SIRTl激活劑中吸引了眾多努力。已鑒定出顯示比白藜蘆醇顯著較高的SIRTl激活潛力的化合物，這些化合物可誘導(dǎo)與白藜蘆醇類(lèi)似的模擬CR的有益作用。另外，據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇特異性地提高針對(duì)熒光團(tuán)綴合的合成肽(Ac-Arg-His-Lys-LysAe-AMC) (SEQ IDNO:1)而非未修飾的合成肽的SIRTl活性(Borra等，2005 ;Kaeberlein等，2005)。這一發(fā)現(xiàn)后來(lái)得到其它研究者的證實(shí)，表明白藜蘆醇和SRT1720不提供針對(duì)其全長(zhǎng)天然靶蛋白(包括 p53 和 PGC-1 α )的任何 SIRTl 活化(Beher 等，2009 ；Dai 等，2010 ；Pacholec 等，2010)。因此，盡管白藜蘆醇和模擬物的各種有益作用，但是基本機(jī)制仍不清楚。
[0013]發(fā)明簡(jiǎn)述
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)經(jīng)由相互作用改進(jìn)化合物改進(jìn)核纖層蛋白A與SIRTl的結(jié)合親和力而在一種或多種細(xì)胞中調(diào)節(jié)SIRTl的脫乙酰酶活性的方法。SIRTl的脫乙酰酶活性可通過(guò)核纖層蛋白A與SIRTl的結(jié)合親和力提高而提高，并且通過(guò)核纖層蛋白A與SIRTl的結(jié)合親和力降低而降低。相互作用改進(jìn)化合物的實(shí)例包括但不限于白藜蘆醇。在本文所述實(shí)施方案中，白藜蘆醇提高核纖層蛋白A與SIRTl的結(jié)合親和力。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，經(jīng)由相互作用改進(jìn)化合物通過(guò)提高核纖層蛋白A蛋白的羧基端與SIRTl蛋白的結(jié)合能力來(lái)調(diào)節(jié)SIRTl脫乙酰酶活性。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)核纖層蛋白A和SIRTl蛋白間的相互作用和核纖層蛋白A的SIRTl激活/抑制性質(zhì)篩選調(diào)節(jié)SIRTl脫乙酰酶活性的作用劑的方法。一些方法包括使候選分子與試驗(yàn)樣品中表達(dá)SIRTl的細(xì)胞接觸；測(cè)定試驗(yàn)樣品中的脫乙酰酶活性；如果分子改變?cè)囼?yàn)樣品中SIRTl脫乙酰酶活性的水平，則選擇該候選分子為調(diào)節(jié)SIRTl脫乙酰酶活性的作用劑。激活或提高SIRTl脫乙酰酶活性的候選分子包括但不限于核纖層蛋白A的肽片段，包括核纖層蛋白A的羧基結(jié)構(gòu)域的肽片段；核纖層蛋白A的類(lèi)似物，包括所述類(lèi)似物的肽片段；提高核纖層蛋白A與SIRTl結(jié)合的化合物；提高或誘導(dǎo)核纖層蛋白A表達(dá)的化合物；及其組合。抑制或降低SIRTl脫乙酰酶活性的候選分子包括但不限于核纖層蛋白A的肽片段，包括核纖層蛋白A肽的羧基結(jié)構(gòu)域；核纖層蛋白A的類(lèi)似物，包括所述類(lèi)似物的肽片段；抑制核纖層蛋白A活性的作用劑或化合物；抑制核纖層蛋白A表達(dá)的作用劑或化合物；及其組合。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療其中調(diào)節(jié)SIRTl脫乙酰酶活性是有益的疾病或病況的方法。所述方法包括給予需要所述治療的受試者有效量的調(diào)節(jié)SIRTl脫乙酰酶活性的作用劑。在一些實(shí)施方案中，所給予的作用劑提高SIRTl脫乙酰酶活性。SIRTl激活性化合物的實(shí)例包括但不限于核纖層蛋白A的肽片段，包括核纖層蛋白A的羧基結(jié)構(gòu)域的片段；核纖層蛋白A的類(lèi)似物或其片段；提高核纖層蛋白A與SIRTl結(jié)合的化合物；及其組合。在其它實(shí)施方案中，所給予的作用劑降低SIRTl脫乙酰酶活性。所述作用劑包括但不限于核纖層蛋白A的羧基末端肽和核纖層蛋白A的羧基末端肽的類(lèi)似物。
[0016]導(dǎo)致SIRTl脫乙酰酶活性提高的本發(fā)明方法的實(shí)施方案可用于治療其中增加骨髓基質(zhì)細(xì)胞和/或造血干細(xì)胞的數(shù)目和/或功能是有益的疾病或病況，例如但不限于代謝和/或衰老相關(guān)變性疾病。因此，例如可發(fā)生骨密度的增加和骨丟失的防止。此外，導(dǎo)致SIRTl脫乙酰酶活性降低的本發(fā)明方法的實(shí)施方案可用于治療瘤形成和其它惡性腫瘤。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于提高一種或多種細(xì)胞的SIRTl脫乙酰酶活性的方法。所述方法包括以有效提高SIRTl的脫乙酰酶活性的量將核纖層蛋白A肽、核纖層蛋白A肽的類(lèi)似物或其功能片段給予或接觸表達(dá)SIRTl并需要提高的SIRTl脫乙酰酶活性的一種或多種細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的有用的核纖層蛋白A肽是人源的，具有(SEQID N0:2 ;GenBank登錄號(hào)NP_733821)的氨基酸序列或其類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提高SIRTl脫乙酰酶活性的核纖層蛋白A肽的功能片段包含核纖層蛋白A的羧基結(jié)構(gòu)域或其類(lèi)似物。核纖層蛋白A肽的羧基結(jié)構(gòu)域可包括SEQ ID NO: 2的氨基酸567-646或其一個(gè)或多個(gè)片段。特別有用的片段長(zhǎng)度為約3個(gè)氨基酸-約50個(gè)氨基酸。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于降低或抑制一種或多種細(xì)胞的SIRTl脫乙酰酶活性的方法。所述方法包括將核纖層蛋白A蛋白或肽的抑制劑給予表達(dá)SIRTl并需要SIRTl脫乙酰酶活性降低的一種或多種細(xì)胞。本發(fā)明實(shí)施方案的有用的核纖層蛋白A抑制劑包括但不限于抑制核纖層蛋白A活性的作用劑；和降低或抑制核纖層蛋白A表達(dá)的作用劑，例如抑制核纖層蛋白A的轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或加工的作用劑。
[0019]附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示SIRTl與核纖層蛋白A相互作用，且前核纖層蛋白A/progerin的形成損害SIRTl-核纖層蛋白A相互作用。(A) FLAG-SIRT1和核纖層蛋白A在HEK293細(xì)胞中異位表達(dá)。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法，在抗FLAG免疫沉淀中檢出核纖層蛋白A ;在抗核纖層蛋白Α/C免疫沉淀中檢出FLAG-SIRT1。(B)在HEK293細(xì)胞的總細(xì)胞裂解物中，通過(guò)抗核纖層蛋白Α/C免疫沉淀檢出內(nèi)源SIRT1，相反地，通過(guò)抗SIRTl免疫沉淀檢出內(nèi)源核纖層蛋白A。(C)人成纖維細(xì)胞中SIRTl和核纖層蛋白Α/C的免疫熒光染色和共焦顯微術(shù)。大部分的核SIRTl與核纖層蛋白A在核內(nèi)(箭頭)共定位。比例尺為5 Mffl0⑶共焦顯微術(shù)顯示異位EGFP-SIRT1和DsRed-核纖層蛋白A在人成纖維細(xì)胞細(xì)胞中共定位。比例尺為10 Pm。(E)在含有rhSIRTl和重組人核纖層蛋白A (rhLamin A)的試管中，通過(guò)抗核纖層蛋白A免疫沉淀檢出重組人SIRTl (rhSIRTl)。(F)在HEK293細(xì)胞中，在抗FLAG-SIRT1免疫沉淀中檢出核纖層蛋白A，而非核纖層蛋白C。(G)將HEK293細(xì)胞用FLAG-SIRT1連同A型核纖層蛋白(即野生型核纖層蛋白A)、未加工的前核纖層蛋白A和progerin之一瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法以測(cè)定抗FLAG免疫沉淀中A型核纖層蛋白的水平。注意與野生型核纖層蛋白A相比，通過(guò)抗FLAG抗體檢出顯著較少的前核纖層蛋白A/progerin。(H) (G)的定量。數(shù)據(jù)表示均值土SEM, η = 3。**尸 < 0.0l0
[0020]圖2顯示早衰樣細(xì)胞中SIRTl的錯(cuò)定位和脫乙酰酶活性降低。㈧顯示核(Nu，Pl)和核基質(zhì)(W，P2’)級(jí)分中各種蛋白質(zhì)的代表性免疫印跡。匪締合的SIRTl在
BMSC中顯著降低，而在NM級(jí)分中，野生型和Zmps te24 7 BMSC間的S ir t6、CBP、Foxo3a、組蛋白H3和β-肌動(dòng)蛋白的水平相當(dāng)?？偟腟IRTl核水平不改變。(B) (A)的定量。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 3。**P < 0.0l0 (C)核纖層蛋白A、未加工的前核纖層蛋白A或progerin在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)分離和蛋白質(zhì)印跡法以測(cè)定匪締合的SIRT1。雖然與野生型核纖層蛋白A相比，在前核纖層蛋白A-和progerin轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中匪締合的SIRTl降低，但是FoXo3a和β-聯(lián)蛋白的水平保持不變。(D) (C)的定量。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 3。**P〈 0.01。(E)抗Foxo3a免疫沉淀中通過(guò)用抗乙酰賴(lài)氨酸抗體的蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定的Z尊匆7BMSC中Foxo3a的高度乙?；?F) (E)的定量。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 3。*尸〈0.05, W < 0.01。(G)上圖，在抗Foxo3a免疫沉淀中通過(guò)用抗乙酰賴(lài)氨酸抗體的蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定的表達(dá)異位核纖層蛋白A或前核纖層蛋白A或progerin的HEK293細(xì)胞中Foxo3a的乙?；?；下圖，輸入中的過(guò)氧化氫酶、MnSOD和GADD45 α的表達(dá)。
[0021]圖3顯示白藜蘆醇以核纖層蛋白A依賴(lài)性方式直接激活SIRT1。㈧在rhLaminA 存在或不存在時(shí)通過(guò) B1Mol? SIRTl Fluorimetric Drug Discovery Kit (BSDK)測(cè)定RhSIRTl脫乙酰酶活性。數(shù)據(jù)表示均值± SEM, η = 3。*尸〈0.05，林Z5 < 0.01，rhLaminA + rhSIRTl 與僅 rhSIRTl。林* rhLamin A 與 rhSIRTl 的摩爾比率分別為 0.5、1.0、2.0 和4.0。(B)在白藜蘆醇存在或不存在時(shí)將乙酰FLAG-p53與rhSIRTl和rhLamin A—起溫育。通過(guò)用抗乙酰賴(lài)氨酸抗體的蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定FLAG-p53乙?；?。通過(guò)Image J?量化乙酰化p53的相對(duì)水平。^rhLamin A與rhSIRTl的摩爾比率分別為0.5、1.0和2.0。(C)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法評(píng)價(jià)在白藜蘆醇存在或不存在時(shí)通過(guò)抗核纖層蛋白Α/C抗體檢出的rhSIRTl水平。(D)將FLAG-SIRT1和核纖層蛋白A共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。將細(xì)胞用白藜蘆醇處理接著抗FLAG免疫沉淀。蛋白質(zhì)印跡法顯示，白藜蘆醇處理以劑量依賴(lài)性方式增加SIRTl和核纖層蛋白A間的相互作用。(E) (D)的定量。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 3?！?0.05。(F)用不同劑量的白藜蘆醇處理的野生型、無(wú)SIRTl和無(wú)Z皿7a細(xì)胞的代表性免疫印跡。(G)用或未用白藜蘆醇處理的野生型和無(wú)Z皿?a細(xì)胞中H3K9ac的免疫熒光染色。(H)在試管中白藜蘆醇提高rhSIRTl與匪的締合。按與進(jìn)行SIRTl脫乙酰酶活性測(cè)定法類(lèi)似的方式，將重組hSIRTl在白藜蘆醇(10 μΜ)存在或不存在時(shí)與由野生型或ZmpsteZ^ BMSC制備的匪級(jí)分一起溫育。不溶性匪和反應(yīng)緩沖液通過(guò)離心分離。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法和考馬斯藍(lán)染色測(cè)定rhSIRTl的水平。
[0022]圖4顯示在Z尊小鼠中白藜蘆醇以SIRTl依賴(lài)性方式挽救骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)的減少。㈧白藜蘆醇(10 μΜ)提高為妨仏匆7BMSC的集落形成能力。在白藜蘆醇存在和不存在時(shí)在10 cm培養(yǎng)皿中對(duì)新分離的骨髓細(xì)胞進(jìn)行集落形成測(cè)定法。(B)集落數(shù)計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)顯示，白藜蘆醇(RSV)以劑量依賴(lài)性方式(2 μΜ和10 μΜ)提高Zmpste24,BMSC的集落形成能力。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 4?！?0.05，白藜蘆醇與溶媒。(C)左圖，在用或未用白藜蘆醇(2 μΜ)處理的BMSC中通過(guò)抗SIRTl免疫沉淀檢出的前核纖層蛋白A的水平通過(guò)免疫印跡法測(cè)定；右圖，通過(guò)免疫印跡法評(píng)價(jià)白藜蘆醇中乙酰化Foxo3a的水平。(D)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定的在白藜蘆醇(10 μM)存在或不存在時(shí)SIRTl或雜亂siRNA處理的ZmpsteZV BMSC中過(guò)氧化氫酶和Gadd45 α的水平。(E)在白藜蘆醇存在或不存在時(shí)SIRTl或雜亂敲減(scramble knocking down)引起的BMSC的集落形成能力。白藜蘆醇處理(10 μΜ)提高BMSC中的集落形成能力(左)，通過(guò)敲減SIRTl集落形成能力被完全破壞(右)。在6孔板中對(duì)新分離的細(xì)胞進(jìn)行集落形成測(cè)定法。(F) (E)的定量。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 5?！?0.05，“雜亂+白藜蘆醇”與“雜亂+ Veh"o (G)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法評(píng)價(jià)野生型和無(wú)Zmpste24的BMSC中在有或沒(méi)有異位SIRTl時(shí)H3K9ac和IR誘導(dǎo)的-H2AX的水平。(H)異位SIRTl提高Z尊和野生型BMSC的集落形成能力。在6 cm培養(yǎng)皿中對(duì)新分離的細(xì)胞進(jìn)行集落形成測(cè)定法。(I) (H)的定量。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，η = 5?！?0.05，SIRTl與模擬品。
[0023]圖5顯示白藜蘆醇在小鼠中挽救ASC下降、改善早衰樣特征并延長(zhǎng)壽命。㈧用溶媒或白藜蘆醇(20 μ g/ml，在飲用水中)治療的Zmps te24 /小鼠中BMSC的集落形成能力。在10 cm培養(yǎng)皿中對(duì)新分離的骨髓細(xì)胞進(jìn)行集落形成測(cè)定法。(B) (A)的定量。數(shù)據(jù)表示BMSC的平均集落數(shù)土 SEM，n=3。*P < 0.05。(C)自溶媒治療和白藜蘆醇治療的Zmpstd^&鼠分離的BMSC中過(guò)氧化氫酶、乙?；痯53和H3K9ac的水平。(D)用白藜蘆醇飼喂Z尊小鼠增加HSC群。每個(gè)點(diǎn)代表個(gè)體小鼠的總的骨髓單核細(xì)胞中HSC群的百分比。0.05，溶媒治療的Z尊小鼠相對(duì)于野生型，和白藜蘆醇治療(20 μ g/ml，在飲用水中)相對(duì)于溶媒治療的Zmps te24 /小鼠。(E)野生型小鼠和用白藜蘆醇(20 μ g/ml，在飲用水中)或溶媒治療的Zmpste24,小鼠中骨小梁結(jié)構(gòu)的微CT檢查。(F)白藜蘆醇治療增加為小鼠的骨礦物密度。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，η =3。< 0.05，溶媒治療小鼠相對(duì)于野生型，和白藜蘆醇治療(20 yg/ml，在飲用水中)相對(duì)于溶媒治療的小鼠。(G)白藜蘆醇治療和溶媒治療的雄性Z尊小鼠的體重。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 10。*/5〈 0.05。⑶白藜蘆醇治療和溶媒治療的雌性Z尊小鼠的體重。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM，n = 10。< 0.05。(I)白藜蘆醇治療和溶媒治療的小鼠的存活率。Z5〈 0.0001。(J)白藜蘆醇治療和溶媒治療的乃取?ie匆/小鼠的最大壽命。數(shù)據(jù)表示均值土 SEM。**P < 0.01。
[0024]圖6顯示核纖層蛋白A與SIRTl相互作用。(A)通過(guò)免疫共沉淀測(cè)定BMSC中核纖層蛋白A和SIRTl間的內(nèi)源相互作用。(B)通過(guò)免疫共沉淀測(cè)定野生型和無(wú)Z皿^小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中核纖層蛋白A和SIRTl間的內(nèi)源相互作用。(C)通過(guò)抗GFP免疫共沉淀評(píng)價(jià)GFP-核纖層蛋白A和SIRTl、SIRT2和SIRT5間的相互作用。
[0025]圖7顯示早衰細(xì)胞中SIRTl的錯(cuò)定位和脫乙酰酶活性降低以及在核纖層蛋白A存在時(shí)通過(guò)白藜蘆醇對(duì)SIRTl的激活。(A)不同的亞細(xì)胞級(jí)分中Kap-1和Mcm3的表達(dá)。將細(xì)胞分級(jí)分離，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定Kap-1和Mcm3的亞細(xì)胞分布。(B) 57無(wú)77 7和野生型MEF被分級(jí)分離成胞質(zhì)(〇7切，51)、核質(zhì)/染色質(zhì)(Np+Chr，S2’)和核基質(zhì)(NM，P2，)級(jí)分。顯示匪締合的SIRTl的代表性免疫印跡。(C)在來(lái)源于健康個(gè)體和具有不同Z#遍基因突變的患者的真皮成纖維細(xì)胞中通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定的核和NM級(jí)分中的SIRTl表達(dá)。注意，與來(lái)自健康個(gè)體或具有非早衰LMM突變的患者的細(xì)胞中的相比，在HGPS細(xì)胞中NM締合的SIRTl被顯著減量調(diào)節(jié)。在HGPS細(xì)胞中總的SIRTl核水平也降低。⑶人細(xì)胞中SIRTl的定量。與來(lái)自非早衰核纖層蛋白病(Iaminopathy)患者和健康個(gè)體的真皮成纖維細(xì)胞中的相比，HGPS成纖維細(xì)胞中匪締合的SIRTl相對(duì)于總的核SIRTl顯著減量調(diào)節(jié)。(E)在