一種降血壓肽微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及降血壓肽，尤其是涉及一種降血壓肽微球的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽（ACEIP)又稱為降血壓肽，是由蛋白酶水解動(dòng)植物蛋白 質(zhì)而獲得的一類具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制活性和降血壓作用的小肽。與現(xiàn)有的 ACE抑制劑類降壓藥物如卡托普利等相比，ACEIP效果溫和、無(wú)副作用、對(duì)正常血壓無(wú)影響， 而且可通過日常飲食攝入，因此是一類理想的天然降血壓物質(zhì)，已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛 關(guān)注。VLPVP是一種基因工程方法制備的降血壓肽，體外實(shí)驗(yàn)表明，該多肽對(duì)ACE都有很強(qiáng) 的抑制作用，其IC5。分別為1.8ymol/L。通過研究VLPVP對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR)的降 壓效果，結(jié)果表明，該降血壓肽具有良好的體內(nèi)降血壓效果，但對(duì)血壓正常的大鼠無(wú)降血壓 作用，因此具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景。然而，大量研究表明，當(dāng)ACEIP以口服形式攝入時(shí)，極 易被胃腸道蛋白酶降解進(jìn)而失去體內(nèi)降壓活性，因此ACEIP的體內(nèi)穩(wěn)定性和降壓活性已經(jīng) 成為一個(gè)制約ACEIP產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題。
[0003] 水凝膠體系也是目前提高蛋白質(zhì)以及多肽類藥物體內(nèi)穩(wěn)定性以及實(shí)現(xiàn)腸道靶向 釋放的重要方法。水凝膠是一類具有親水基團(tuán)，能被水溶脹但不溶于水的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié) 構(gòu)的聚合物，能夠感知外界刺激的微小變化，如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、電場(chǎng)、磁場(chǎng)等，通過體 積的溶脹或收縮對(duì)刺激做出敏感性的相應(yīng)。水凝膠的這一特點(diǎn)使它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、生物 酶的固定等方面有廣泛的應(yīng)用前景。目前在蛋白質(zhì)和多肽靶向輸送中應(yīng)用得最多的是pH 敏感性水凝膠。殼聚糖-海藻酸鈉水凝膠體系已被廣泛用于蛋白質(zhì)和多肽類藥物的腸道靶 向釋放。
[0004]SPG膜乳化法主要用于制備尺寸均一的乳液、乳珠、微球、微膠囊等，可用于制備W/0、0/W、W/O/W、0/W/0不同乳液，實(shí)現(xiàn)乳液的尺寸均一性和可控性、微球表面功能的可控 性和穩(wěn)定性、多孔微球結(jié)構(gòu)的可控性和穩(wěn)定性；實(shí)現(xiàn)均一乳液大規(guī)模制備的可行性；多孔 微球或緩釋膠囊粒徑的可控性等。SPG膜乳化法制備的微球，粒徑范圍為2~100ym，在 各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，在生物工程領(lǐng)域可以作為活性物質(zhì)的分離介質(zhì)，在藥學(xué)領(lǐng)域可以 作為控制藥物釋放的載體，在攝影領(lǐng)域可以作為固液態(tài)的調(diào)色劑等等。其中藥學(xué)和食品是 膜乳化應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，通過不同的制備方式將水溶性的抗癌藥物包埋制備成微球或微 囊，提高生物利用率，均一的乳液還可以有效保持食品風(fēng)味和良好口感，掩蓋住個(gè)別食品的 刺激性氣味等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種降血壓肽微球的制備方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)將VLPVP溶解在SAL溶液中作為水相，油相為液體石蠟和石油醚混合物，所述混 合物中含乳化劑，將烘干的SPG膜放入油相中超聲，安裝到SPG膜乳化器中，在氮?dú)鈮毫ο?水相通過SPG膜進(jìn)入油相中，得SAL乳狀液；
[0008] 2)將CaCl2溶液與步驟1)中的油相混合，超聲后得乳狀液，再與步驟1)所得SAL 乳狀液混合，即得乳白色乳狀液，離心后，除去上清液，離心清洗，再除去上清液后，得到海 藻酸鈉-鈣微球，抽濾清洗，除去微球表面的有機(jī)溶劑，然后將微球分散到0-CMC溶液中，得 到負(fù)載VLPVP的0-CMC-SAL微球，再抽濾，除去表面殘留的0-CMC，干燥后即得降血壓肽微 球。
[0009] 在步驟1)中，所述SAL溶液可采用體積百分比為1. 5%，pH為4. 2的SAL溶液； 所述VLPVP與SAL溶液的配比可為100mg: 50mL，其中，VLPVP以質(zhì)量計(jì)算，SAL溶液以體 積計(jì)算；所述液體石蠟和石油醚的體積比可為7 : 5;所述乳化劑可采用P0-500乳化劑，所 述乳化劑的含量按質(zhì)量百分比可為液體石蠟和石油醚混合物的4%;所述超聲的時(shí)間可為 30min;所述SPG膜的孔徑可為20ym;所制得的SAL乳狀液為W/0型SAL乳狀液，在SAL乳 狀液中水相與油相的體積比可為1 : 10。
[0010] 在步驟2)中，所述CaCl2溶液可采用體積百分比為2%，pH為6的CaCl2溶液；所 述CaCl2溶液與油相的體積比可為1 : 1;所述攪拌的條件可為300rmp下攪拌5h;所述離 心清洗可采用石油醚離心清洗2次，離心的條件可為SOOOrmp下離心5min，20°C;所述抽濾 清洗可采用去離子水抽濾清洗；所述0-CMC溶液的體積百分比濃度可為0. 5%;所述再抽濾 可采用去離子水抽濾；所述干燥可采用真空冷凍干燥24h。
[0011] 本發(fā)明以海藻酸鈉（sodiumalginate,SAL)和羧甲基殼聚糖（〇-carboxymethyl chitosan，0-CMC)為壁材，以CaC12為交聯(lián)劑，采用SPG膜乳化法制備VLPVP微球，確定SPG 膜乳化法制備微球的最佳工藝，并檢測(cè)了該微球在模擬胃腸液的釋放效果。本發(fā)明利用SPG 膜乳化法得到的VLPVP微球具有良好的pH敏感性，而且粒徑分布均勻，并且可以較好的保 持VLPVP的活性，因此在pH敏感性傳輸體系的構(gòu)建中具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為VLPVP微球形態(tài)。
[0013] 圖2為VLPVP微球掃描電鏡圖。標(biāo)尺為10ym。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0015] 1.降血壓肽微球的制備
[0016] 在室溫（20°C)下，準(zhǔn)確稱取一定量的VLPVP，使其充分溶解在1. 5% (v/w)pH4. 2 的SAL溶液中作為水相，使VLPVP的最佳投藥量為100mg/50mLSAL溶液；油相為液體石蠟 和石油醚7 : 5(v/v)混合物，其中含4% (w/w)的P0-500乳化劑。將烘干的SPG膜放入油 相中超聲30min，安裝到SPG膜乳化器中。在氮?dú)鈮毫ο?0mL水相通過孔徑20ym的SPG 膜，進(jìn)入到500mL油相中，形成W/0型SAL乳狀液（水油體積比為1 : 10)。
[0017] 將50mL2% (v/w)的pH= 6的CaCl2溶液與50mL上述的油相混合，攪拌超聲后 形成均一乳狀液，再與SAL乳狀液混合，為了保證形成均一的水凝膠微球，混合過程一定要 緩慢進(jìn)行?；旌虾?00rmp攪拌5h，形成均一的乳白色乳狀液，倒入離心管中離心后，除去上 清液，再用石油醚離心清洗2次（SOOOrmp，5min，20°C)，除去上清液后，得到海藻酸鈉-鈣 微球，用去離子水抽濾清洗，除去微球表面的有機(jī)溶劑；然后將微球分散到50mL0.5% (v/w)的0-CMC溶液中，300rmp攪拌lh，制備得到負(fù)載VLPVP的0-CMC-SAL微球，得到的微球用 去離子水抽濾，除去表面殘留的0-CMC，真空冷凍干燥24h，得到VLPVP微球。
[0018] 2.VLPVP微球包埋率的測(cè)定
[0019] 2. 1VLPVP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0020] 用高效液相色譜法繪制谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取VLPVP標(biāo)準(zhǔn) 品適量，加入去離子水溶解成質(zhì)量濃度為500mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再按一定的比例稀釋成 25yg/L、125yg/L、250yg/L、375yg/L、500yg/L和 625yg/L濃度的溶液，經(jīng) 0? 22ym的 濾膜過濾后，進(jìn)樣測(cè)定。色譜條件為：Eclipse)(DB-C18反相色譜柱（4. 6X250mm，5iim)d^ 動(dòng)相乙腈：水=17:83,其中水相中含有0.05%三氟乙酸（TFA)，超聲脫氣15min，進(jìn)樣流速 為1.OmL/min，柱溫保持30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為199nm，進(jìn)樣量為20yL。以谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的 濃度（C)為橫坐標(biāo)，峰面積（A)為縱坐標(biāo)作線性回歸方程