切面紅色土茯苓的有效部位及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及切面紅色土茯苓的有效部位及其應(yīng)用，屬于中藥技術(shù)的領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 土茯苳為百合科植物光葉菝葜（Smilax glabra Roxb.)的干燥根莖，土茯苳的應(yīng) 用廣泛，是藥食同源的傳統(tǒng)藥材，具有解毒，除濕，通利關(guān)節(jié)等功效。市售土茯苓切面均為 白色，，而產(chǎn)于貴州的土茯苓切面卻為紅色，故貴州苗族稱之"紅土茯苓"，是具有貴州地域 特點(diǎn)的苗族常用大宗傳統(tǒng)藥材，蘊(yùn)藏量大并有資源優(yōu)勢(shì)?！锻淋蜍叩纳帉W(xué)研究》（貴陽中 醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，第33卷第3期，第18-20頁，2011年5月。）對(duì)切面為紅色（文中也稱紅棕 色）的土伏苓作了藥材性狀鑒別、粉末顯微鑒別以及薄層鑒別，鑒別結(jié)果見《土茯苓的生藥 學(xué)研究》一文，研究結(jié)果表明斷面紅色與斷面白色的土茯苓（即普通土茯苓）在性狀、顯微 特征上均有較大的差異；該文參照2010版藥典方法改進(jìn)后進(jìn)行了薄層鑒別研究，斷面紅色 或白色的土茯苓在斑點(diǎn)數(shù)量、顏色及亮度上有較大的區(qū)別，表明二者所含成分有較大差異。 《斷面紅棕色及類白色土茯苓抗炎作用的比較研究》（中藥藥理與臨床，2012 ;28 (6)，第103 頁-105頁，2012年）對(duì)斷面紅棕色及類白色土茯苓抗炎作用進(jìn)行了比較研究。研究結(jié)果表 明，在一般抗炎作用中，與白色土茯苓相比，斷面紅棕色土茯苓顯示了其對(duì)滲出型炎癥模型 (小鼠毛細(xì)血管通透性）、增殖型炎癥模型（小鼠棉球肉芽腫）、炎癥物質(zhì)N0濃度測(cè)定（大 鼠急性炎癥）均有更為優(yōu)異的抑制作用。但是，目前尚未有關(guān)于切面紅色土茯苓在抗炎等 功能中有效部位的確定、該有效部位的提取工藝及其它應(yīng)用的研究和報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于，提供一種切面紅色土茯苓的有效部位。此外本發(fā)明還提供了它 在治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的新應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案：切面紅色土茯苓有效部位，為切面紅色土茯苓的總黃酮部 位。
[0005] 上述的切面紅色土茯苓有效部位中，所述的總黃酮部位為總黃酮的乙酸乙酯部 位。
[0006] 前述的切面紅色土茯苓有效部位中，所述的總黃酮部位是黃酮類成分占總黃酮部 位固體的比例超過90 %。
[0007] 前述的切面紅色土茯苓有效部位中，通過高效液相分析，所得圖譜中含有以下7 個(gè)峰：
[0008] 峰1 (5-0-咖啡?；Р菟幔罕Ａ魰r(shí)間7. 14min，峰面積409455 ;
[0009] 峰2 (黃酮類成分）：保留時(shí)間10. 204min，峰面積211285 ;
[0010] 峰3 (新落新婦苷）：保留時(shí)間12. 786min，峰面積343899;
[0011] 峰4 (落新婦苷）：保留時(shí)間13. 569min，峰面積3238258;
[0012] 峰5 (新異落新婦苷）：保留時(shí)間15. 844min，峰面積632227 ;
[0013] 峰6 (異落新婦苷）：保留時(shí)間16. 556min，峰面積297982 ;
[0014] 峰7 (黃杞苷）：保留時(shí)間18. 083min，峰面積328977 ;
[0015] 色譜條件：
[0016] Hypersil 0DS2 C18色譜柱流動(dòng)相：A為0? 05%磷酸水，B為乙腈，梯度洗脫：0~ 2〇1^11，10%~24%;梯度曲線均為直線；流速 ：0.811117111111;柱溫：25°(：;檢測(cè)波長(zhǎng) ：29111111;進(jìn) 樣量10 y L。
[0017] 前述的切面紅色土茯苓有效部位中，該有效部位的制備方法依次包括以下步驟；
[0018] a、提取工藝：稱取一定量的切面紅色土茯苓藥材粗粉，第一次加入10倍量的70% 的乙醇浸泡過夜，回流提取1. 5h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后開始計(jì)時(shí)），過濾，得濾液； 第二次加入8倍量的70%的乙醇，回流提取lh(冷凝管有液滴滴出，并微沸后開始計(jì)時(shí)）， 過濾，得濾液；第三次加入8倍量的70 %的乙醇，回流提取lh(冷凝管有液滴滴出，并微沸 后開始計(jì)時(shí)），過濾，得濾液，合并3次濾液，60°C減壓回收乙醇；
[0019] b、除糖工藝：將70%的乙醇提取物60°C減壓回收乙醇，濃縮至與原藥材的比例為 1. 5:1時(shí)，取出，放冷至室溫后。量取濃縮液的體積，再緩慢加入一定量的95%的乙醇，使含 醇量達(dá)到85%，緩慢攪勻，于4°C的冰箱中放置過夜，第二日取出，過濾沉淀，再用95%的乙 醇洗滌沉淀3~5次，直至洗滌液顏色清淡為止，過濾沉淀，合并濾液，55°C減壓回收乙醇， 得除糖中間物；
[0020] c、除鞣工藝：將除糖中間物加入一定量的蒸餾水，使其呈良好的流動(dòng)狀態(tài)，以流浸 膏完全溶解且不粘壁為宜，取出，放冷至室溫，倒入適宜容器中，再加入4%的明膠水溶液， 兩者體積比約為1: 1，加入明膠水溶液后，緩慢搖動(dòng)使其充分混勻，不可用力攪拌，室溫靜置 lh，待其完全沉淀后，再加入一定量的95 %的乙醇，使其含醇量為85 %，緩慢搖動(dòng)使其充分 混勻，不可用力攪拌，再室溫靜置lh后，用玻璃棒沿內(nèi)壁緩慢攪拌使其充分混勻，讓鞣質(zhì)成 良好的沉淀狀態(tài)，封口，室溫下放置過夜，第二日取出，過濾沉淀，再用95%的乙醇洗滌沉淀 3~5次，直至洗滌液顏色清淡為止，過濾沉淀，合并所有濾液，50°C減壓回收乙醇，得除鞣 中間物；
[0021] d、萃取工藝：將除鞣中間物加入一定量的甲醇溶液，使其充分溶解，除去甲醇不溶 物（即過量明膠），過濾，合并濾液，50°C減壓回收甲醇至干。再加入一定量的蒸餾水，使其 充分溶解。取出，放冷，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，靜置分層得到下層水溶液，同法乙酸乙酯反復(fù) 萃取數(shù)次，直至乙酸乙酯層顏色清淡為止，合并乙酸乙酯萃取液，50°C減壓回收溶劑至干， 使旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)形成良好的結(jié)晶狀態(tài)，得成品。
[0022] 前述的切面紅色土茯苓有效部位中，該有效部位的使用劑量為0. 05g/kg~ 0?25g/kg。
[0023] 前述的切面紅色土茯苓有效部位中，該有效部位的使用劑量為0. lg/kg或0. 2g/ kg〇
[0024] 前述的切面紅色土茯苓有效部位中，該有效部位可制成任何一種臨床上或藥學(xué)上 可接受的制劑。
[0025] 前述的切面紅色土茯苓有效部位在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物中的 應(yīng)用。
[0026] 前述的切面紅色土茯苓有效部位在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的保健品或 者其它功能性食品的應(yīng)用。
[0027] 前述的切面紅色土茯苓有效部位中，切面紅色土茯苓總黃酮部位對(duì)大鼠佐劑性關(guān) 節(jié)炎預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)中，所述的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷７椒ㄊ牵?br>[0028] a、第一次免疫刺激：取卡介苗凍干粉，80°C滅活lh后，與液體石蠟于研缽內(nèi)研磨 混勻，制備成含卡介苗濃度3mg/ml的混懸液，即弗氏完全佐劑，備用；將大鼠使用乙醚麻醉 后，以75%酒精常規(guī)消毒，然后在右足足趾皮下以0. lml/只注射弗氏完全佐劑，達(dá)到刺激 機(jī)體免疫的目的；
[0029] b、正式造模：第一次免疫刺激7天后，取卡介苗凍干粉，80°C滅活lh后，與液體 石蠟于研缽內(nèi)研磨混勻，制備成含卡介苗濃度15mg/ml的混懸液，即弗氏完全佐劑，備用； 將大鼠使用乙醚麻醉后，剔掉尾根部的毛發(fā)，以75%酒精消毒，然后在尾根部經(jīng)皮內(nèi)以 0. lml/只注射弗氏完全佐劑，以誘導(dǎo)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的有益效果如下：
[0031] 1、本發(fā)明切面紅色土茯苓的有效部位為總黃酮部位，試驗(yàn)表明總黃酮部位在滲出 型炎癥模型（小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性）、增生型炎癥模型（小鼠棉球肉芽腫）中的抑制率 優(yōu)于其它部位，說明總黃酮部位確實(shí)為切面紅色土茯苓抗炎有效部位。
[0032] 2、申請(qǐng)人經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)、篩選、比較和總結(jié)，確定了切面紅色土茯苓有效部位總 黃酮部位的制備方法（也即提取方法），試驗(yàn)結(jié)果以切面紅色土茯苓中主要化學(xué)成分落新 婦苷峰面積計(jì)，其含量占總量的59. 8%，以總黃酮各成分的峰面積和計(jì)，其含量占總量的 94. 2%，表明該制備方法制得的總黃酮部位純度高、效果好。試驗(yàn)結(jié)果還表明該制備方法重 復(fù)性、穩(wěn)定性較好。
[0033] 3、動(dòng)物急毒實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明經(jīng)口給藥的安全范圍很大、無毒性，安全性較高。
[0034] 4、本發(fā)明的總黃酮部位在低、中劑量（0. 05g/kg_0. 25g/kg)時(shí)，特別是劑量為 0. lg/kg時(shí)，該部位供試藥對(duì)于小鼠慢性增殖型炎癥的抑制率均高于其他劑量，且增大或減 小該最優(yōu)劑量（〇. lg/kg)都使得切面紅色土茯苓總黃酮對(duì)于增殖型炎癥的抑制率降低，因 此本發(fā)明的總黃酮部位的最優(yōu)劑量系0. lg/kg。同時(shí)，該有效部位還能下調(diào)胸腺、脾臟及 腎上腺指數(shù)，并且能夠抑制關(guān)節(jié)滑膜TNF-a及脾臟中IL-6的表達(dá)。在三個(gè)劑量中，低劑 量（0. 1/kg)略優(yōu)于中劑量（0. 2/kg)與高劑量（0.4/kg)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，低劑量 (0. 1/kg)對(duì)大鼠AA模型具有明顯預(yù)防作用同時(shí)對(duì)于機(jī)體的物質(zhì)代謝影響較小。
[0035] 5、本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)表明，切面紅色土茯苓有效部位具有治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 的功能。
【附圖說明】：
[0036] 圖1是對(duì)二甲苯致小鼠腹部毛細(xì)血管通透性抑制率柱狀圖；
[0037] 圖2是重復(fù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)二甲苯致小鼠腹部毛細(xì)血管通透性抑制率柱狀圖；
[0038] 圖3是貴州產(chǎn)切面紅色土茯苓中精制總黃酮部位HPLC色譜圖；
[0039] 圖4是總黃酮部位HPLC特征性圖譜圖；
[0040] 圖5是第1次實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠棉球肉芽腫抑制率柱狀圖；
[0041] 圖6是第2次實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠棉球肉芽腫抑制率柱狀圖；
[0042] 圖7是第3次實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠棉球肉芽腫抑制率柱狀圖；
[0043] 圖8是AA大鼠原發(fā)性足腫脹度變化趨勢(shì)圖；
[0044] 圖9是對(duì)AA大鼠原發(fā)性病變血清N0動(dòng)態(tài)含量趨勢(shì)圖；
[0045] 圖10是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)中AA大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)圖；
[0046] 圖11是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)中AA大鼠足腫脹度變化趨勢(shì)圖；
[0047] 圖12是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)中AA大鼠AI變化趨勢(shì)圖；
[0048] 圖13是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)中AA大鼠臟器指數(shù)柱狀圖；
[0049] 圖14是AA大鼠滑膜TNF-及脾臟IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量圖；
[0050] 圖15是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥重復(fù)實(shí)驗(yàn)中AA大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)圖；
[0051] 圖16是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥重復(fù)實(shí)驗(yàn)中AA大鼠足腫脹度變化趨勢(shì)圖；
[0052] 圖17是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥重復(fù)實(shí)驗(yàn)中AA大鼠AI變化趨勢(shì)圖；
[0053] 圖18是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給藥重復(fù)實(shí)驗(yàn)中AA大鼠臟器（脾臟）指數(shù)柱狀 圖；
[0054] 圖19是大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎預(yù)防性給