化學(xué)梯度的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的奪互參考
[0002] 本申請依據(jù)35 U.S.C. § 119(e)要求2013年2月19日提交的序號為61/766, 366 的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，所述臨時專利申請在此以其全部內(nèi)容引為參考。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦咨助的研究或開發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明根據(jù)國立衛(wèi)生研究院/國立神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和中風(fēng)研究所（National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke) (NIH/NINDS)授予的許可1R21NS072955-01A1，由政府支持完成。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及用于形成化學(xué)梯度的裝置和方法，以及包含化學(xué)梯度的組合物，并特 別涉及用于藥物投送和其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的化學(xué)梯度。
【背景技術(shù)】
[0006] 在損傷發(fā)展和之后的期間，神經(jīng)細(xì)胞響應(yīng)生物分子的梯度迀移并朝著適當(dāng)?shù)陌屑?xì) 胞和器官伸長它們的軸突，所述生物分子或是通過附著于所述細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)、或 是通過分泌到細(xì)胞外液中而引導(dǎo)軸突再生（趨化性）。在一些情況下，趨化性的可溶分子由 特殊的細(xì)胞分泌，并從釋放位點通過擴(kuò)散和對流形成梯度。對這種梯度的細(xì)胞響應(yīng)可受到 所述生物分子的性質(zhì)、和ECM(其可包括膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白）的物理特性例 如基質(zhì)孔度和硬度的影響。在發(fā)展中的周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS)中，神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTF)例如 神經(jīng)生長因子（NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT-3)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)的梯度由遠(yuǎn)端 靶細(xì)胞和直接軸突伸長和脊髓腹側(cè)運動神經(jīng)元（VMN)的靶識別、以及背根神經(jīng)節(jié)（DRG)中 的感覺神經(jīng)元來建立。在成人PNS中，感覺神經(jīng)元的傳出分支在損傷后自發(fā)地恢復(fù)皮膚和 肌肉靶標(biāo)的神經(jīng)支配，但傳入軸突不能進(jìn)入成人脊髓的有害環(huán)境，除非受到誘發(fā)的NGF表 達(dá)的誘使。此外，通過表達(dá)再建立NTF梯度的適當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)，可顯著減少在再生期間由損 傷的VMN和DGR神經(jīng)元產(chǎn)生的導(dǎo)向誤差。
[0007] 不幸的是，在神經(jīng)修復(fù)中生成化學(xué)梯度例如NTF梯度和使用化學(xué)梯度仍然是極度 富有挑戰(zhàn)性的。例如，一些現(xiàn)有技術(shù)未能提供目標(biāo)分子信號的持續(xù)釋放和/或缺乏ECM支 持。其他技術(shù)缺乏提供通常在體內(nèi)存在的非瞬時和/或生理相關(guān)性化學(xué)梯度的能力。另 外，以前一些用于生成化學(xué)梯度的方法只適用于體外短期研究和/或存在與注射病毒載體 有關(guān)的風(fēng)險。因此，需要改進(jìn)的提供化學(xué)梯度的裝置和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本公開涉及通過建立高度可調(diào)的化學(xué)梯度例如NTF或NGF梯度而可用于組織修復(fù) 的方法、裝置和組合物，所述化學(xué)梯度設(shè)計成通過充有ECM的多腔（multiluminal)或多通 道水凝膠來引導(dǎo)軸突生長。為此，本公開涉及錨定于水凝膠微通道壁的新的盤卷聚合結(jié)構(gòu)， 所述結(jié)構(gòu)用于建立滲透所述腔膠原蛋白的高度和可預(yù)測調(diào)節(jié)的可控和持續(xù)NTF釋放梯度， 其還穩(wěn)定擴(kuò)散因子的梯度并提供用于軸突伸長的容許和可預(yù)測地調(diào)節(jié)和控制/可控的生 長底物。確定數(shù)學(xué)模型來描述在這種復(fù)雜基質(zhì)中的NTF擴(kuò)散和確定隨時間的腔NTF濃度， 利用DRG體外神經(jīng)生長試驗提供沿著所述三維NGF梯度的趨化性神經(jīng)再生證據(jù)。這種方法 被認(rèn)為在受引導(dǎo)的組織修復(fù)上證明有用，以及其他用途。
[0009] 本公開的方面涉及裝置，其包含至少一個管道，所述管道具有第一端和第二端與 布置在所述管道中并從第一端向第二端延伸的一個或多個微通道。纖維盤卷在至少一個微 通道的外部周圍，其中所述纖維包含活性劑，所述活性劑可操作地擴(kuò)散到所述微通道的內(nèi) 部。在另一個方面，所述管道包含導(dǎo)管例如Micro-Renathane植入管。
[0010] 在又一個方面，所述微通道布置在所述管道中的基質(zhì)材料內(nèi)。此外，所述基質(zhì)材料 可包括瓊脂糖凝膠、乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA)、聚乳酸（PLA)、聚己內(nèi)酯、聚氨酯、聚酯、 聚碳酸酯、膠原蛋白、聚四氟乙烯（PTFE)、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)、乙烯-乙酸乙烯酯共 聚物（EVA)、聚二甲基硅氧烷（PDMS)、聚醚-聚氨酯、聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET)、聚砜 (PS)、聚環(huán)氧乙烷（PE0)或聚乙二醇（PEG)、聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物（PE0-PP0)、聚 烯烴例如聚乙烯（PE)或聚丙烯（PP)，或一種或多種前述項的組合。
[0011] 在又一個方面，所述基質(zhì)材料包含瓊脂糖凝膠，所述瓊脂糖凝膠基于瓊脂糖凝膠 的總重量，包含約1. 5重量％和2. 5重量％之間的瓊脂糖。此外，多個微通道優(yōu)選布置在所 述管道中，和多個纖維盤卷在多個微通道的外部周圍。
[0012] 在又一個方面，所述多個纖維各自盤卷在不同的微通道外部周圍，并且至少兩個 所述盤卷纖維包含不同的活性劑、不同量的活性劑、和/或不同的節(jié)距（pitch)。
[0013] 在又一個方面，所述纖維包含聚合材料或由其形成，所述聚合材料例如乳酸-乙 醇酸共聚物、聚乳酸、己內(nèi)酯或其組合。纖維也可包含其他材料或由其形成。另外，在另一 個方面，所述聚合物是生物降解型。
[0014] 在又一種變化形式中，所述纖維以各向同性構(gòu)造和/或各向異性構(gòu)造盤卷在微通 道的外部周圍。
[0015] 在另一個方面，所述活性劑包含藥物和/或生長因子。
[0016] 本公開的方面還涉及形成化學(xué)梯度的方法，所述方法包括在生物室中布置本文中 描述的任何裝置。其他方面考慮了所述生物室包含神經(jīng)管道。優(yōu)選地，所述活性劑梯度包 括藥物梯度和/或生長因子梯度。
[0017] 本公開的方面也涉及包含盤卷聚合材料的組合物，所述聚合材料包含活性劑，當(dāng) 所述聚合材料布置在生物室中時，所述活性劑可操作地從所述聚合材料中擴(kuò)散出來。在另 一個方面，所述聚合材料優(yōu)選包括乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、己內(nèi)酯、或其組合。在又一 個方面，所述聚合材料是生物降解型的。在又一個方面，所述活性劑包含藥物和/或生長因 子。在又一個方面，所述生物室包括神經(jīng)管道。
[0018] 本公開的其他變化形式還涉及組合物，和包含組合物的裝置，所述組合物包含含 有第一濃度的活性劑的第一凝膠和含有第二濃度的活性劑的第二凝膠，其中所述第一凝膠 和第二凝膠間隔排列以提供所述活性劑的濃度梯度。
[0019] 在另一個方面，所述組合物包含含有第三濃度的活性劑的第三凝膠，所述第一凝 膠、第二凝膠和第三凝膠間隔排列、或取向，以提供包含所述活性劑濃度梯度的梯度區(qū)。在 又一個方面，所述梯度區(qū)包含線性濃度梯度。此外，所述第一、第二和第三凝膠被排列成提 供多個線性濃度梯度，或所述第一、第二和第三凝膠間隔排列或取向以在所述梯度區(qū)之外 還提供非梯度區(qū)。
[0020] 在另一種變化形式中，本公開涉及上面描述的組合物，其中所述第一凝膠和/或 第二凝膠包含瓊脂糖凝膠、乳酸_乙醇酸共聚物、聚乳酸、己內(nèi)酯、或其組合和所述活性劑 包含藥物或生長因子。
[0021] 此外，本公開涉及裝置，其包含管道和布置在所述管道中的任何前述組合物。
[0022] 另外，本公開涉及形成化學(xué)或活性劑濃度梯度的方法，所述方法包括在生物室、例 如神經(jīng)管道中布置任何前述裝置并且其中所述化學(xué)或活性劑濃度梯度包括藥物梯度或生 長因子梯度。
[0023] 此外，本公開涉及形成化學(xué)或活性劑梯度的方法，所述方法包括在生物室、例如神 經(jīng)管道中布置任何前述組合物并且其中所述化學(xué)或活性劑濃度梯度包括藥物梯度或生長 因子梯度。
【附圖說明】
[0024] 圖1A-B示出了包含微通道的管道的透視圖。
[0025] 圖1C示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的裝置的透視圖。
[0026] 圖2示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式，引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)入裝置的混合神經(jīng) 群體的示意性透視圖。
[0027] 圖3示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的裝置的示意性透視圖。
[0028] 圖4A-E示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的裝置的各種組件的照片。
[0029] 圖5A示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的裝置的示意性透視圖。
[0030] 圖5B-D示出了由圖5A的裝置提供的化學(xué)梯度的顯微鏡圖像。
[0031] 圖6示出了與圖5B-D的化學(xué)梯度對應(yīng)的平均細(xì)胞突長度。
[0032] 圖7A示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的化學(xué)梯度的示意性透視圖。
[0033] 圖7B-C示出了包含多個微通道的管道的透視圖。
[0034] 圖7D示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式，包含多個微通道的裝置的透視圖。
[0035] 圖7E示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的裝置的透視圖，和所述裝置對應(yīng) 的密度測定圖譜。
[0036] 圖7Fi_iii示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的裝置的制造方法。
[0037] 圖7G-I是圖7E中顯示的形態(tài)的顯微鏡圖像。
[0038] 圖8A示出了根據(jù)本文中描述的方法的一些實施方式形成的化學(xué)梯度的一系列顯 微鏡圖像。
[0039] 圖8B示出了圖8A的化學(xué)梯度曲線。
[0040] 圖9A-C示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式，安置在化學(xué)梯度中的神經(jīng)細(xì)胞 的顯微鏡圖像。
[0041] 圖10A-I示出了根據(jù)本文中描述的一些實施方式，安置在化學(xué)梯度中的神經(jīng)細(xì)胞 的顯微鏡圖像。
[0042] 圖10J示出了對應(yīng)于圖10A-I的圖形。
[0043] 圖10K示出了對應(yīng)于圖10A-J的校準(zhǔn)曲線。
[0044] 圖11示出了根據(jù)本文中描述的化學(xué)梯度的一些實施方式，分子的釋放輪廓線圖 形。
[0045] 圖12示出了根據(jù)本文中描述的化學(xué)梯度的一些實施方式，分子的釋放輪廓線圖 形。
[0046] 圖13A-D示出了根據(jù)本文中描述的一些實施方式，安置在化學(xué)梯度中的神經(jīng)細(xì)胞 的顯微鏡圖像。
[0047] 圖13E-F示出了圖13A-D對應(yīng)的圖形。
[0048] 圖14A-B示出了根據(jù)本文中描述的一些實施方式，安置在化學(xué)梯度中的神經(jīng)細(xì)胞 的顯微鏡圖像。
[0049] 圖14C示出了圖14A-B對應(yīng)的圖形。
[0050] 圖15A-B示出了根據(jù)本文中描述的一些實施方式，安置在化學(xué)梯度中的神經(jīng)細(xì)胞 的顯微鏡圖像。
[0051] 圖15C-D示出了圖15A-B對應(yīng)的圖形。
[0052] 圖16示出了根據(jù)本文中描述的方法的一種實施方式，軸突生長的轉(zhuǎn)向角比率的 圖形。
[0053] 圖17示出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的組合物的示意性透視圖。
[0054] 圖18不出了根據(jù)本文中描述的一種實施方式的組合物的掃描電子顯微鏡（SEM) 圖像。
【具體實施方式】
[0055] 通過參考以下詳細(xì)說明、實施例和圖，可以更容易地了解本文中描述的方面。然 而，本文中描述的要素、裝置和方法不限于在詳細(xì)描述、實施例和圖中介紹的具體實施方 式。應(yīng)該認(rèn)識到，所公開的實施方式僅僅說明本發(fā)明的原理。許多的