一種多西紫杉醇納米載藥顆粒、其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物材料與納米技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有較高包封率和載藥量、高生物安全性，并且能夠緩慢釋放藥物多西紫杉醇的多西紫杉醇納米載藥顆粒、其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是世界范圍內(nèi)僅次于心血管疾病的第二大嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的疾病。而乳腺癌的發(fā)病率在整個(gè)癌癥中排名第二，是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前對(duì)于乳腺癌的治療手段包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療，但仍以手術(shù)切除為主。分子靶向治療能夠提高腫瘤化療藥物療效，降低其毒副作用，是近年來(lái)乳腺癌治療研究領(lǐng)域最為活躍的部分，對(duì)于提高乳腺癌臨床治療效果具有極其重要的意義，并有可能成為今后乳腺癌藥物研發(fā)的主要方向(http://www.haodf.com/jibing/ruxiana1.htm)。
[0003]多西紫杉醇(docetaxel，DTX)又名多西他賽，是新一代紫杉醇烷類(lèi)抗腫瘤藥物。它通過(guò)作用于細(xì)胞微管與聚合的管蛋白作用并抑制其解聚，使腫瘤細(xì)胞停止在有絲分裂期而死亡，有效抑制腫瘤細(xì)胞的復(fù)制。臨床研究表明，多西紫杉醇可以單獨(dú)或與其他抗腫瘤藥物合用治療非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等癌癥。由于多西紫杉醇具有親脂性，基本不溶于水，因此上市的靜脈注射劑多西紫杉醇濃溶液中含有大量的吐溫80，且需要用13%乙醇稀釋后方能注射。由于吐溫80具有溶血性且黏度較大，臨床試驗(yàn)中大多數(shù)患者產(chǎn)生明顯的過(guò)敏反應(yīng)，并且藥物本身也具有一定的毒副作用，容易引起骨髓抑制，神經(jīng)毒性反應(yīng)，心臟毒性反應(yīng)，關(guān)節(jié)或者肌肉疼痛，肝臟腎臟毒性反應(yīng)等。因此近年來(lái)開(kāi)發(fā)新型多西紫杉醇制劑一直是研究的熱點(diǎn)。
[0004]納米藥物載體通過(guò)將藥物包封于亞微粒中，可以調(diào)節(jié)釋藥的速度，能增加生物膜的透過(guò)性，改變?cè)隗w內(nèi)的分布，提高生物利用度等，為改善抗腫瘤藥物療效和降低腫瘤耐藥性提供了新的思路。而且納米載藥顆粒還有另一優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)納米粒介導(dǎo)的靶向治療。納米粒介導(dǎo)的靶向治療是通過(guò)納米粒子作為載體，包裹藥物(核苷酸、蛋白或小分子化合物)，同時(shí)在納米粒表面連接具有導(dǎo)向功能的靶頭，將藥物遞送到靶向部位，提高藥物在局部的濃集和釋放，從而實(shí)現(xiàn)靶向干預(yù)治療。靶向釋藥系統(tǒng)能夠克服或部分的解決抗腫瘤藥物毒副作用大、水溶性差、半衰期短、生物利用度低等傳統(tǒng)化療中存在的問(wèn)題，在改善化療藥物的體內(nèi)分布特性和藥代動(dòng)力學(xué)特性，增加藥物效力，降低藥物毒性，減少腫瘤多藥耐藥性產(chǎn)生從而提高治療指數(shù)和腫瘤化療效果方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在腫瘤治療中有著非常良好的應(yīng)用前景。
[0005]組織因子(tissue factor, TF)又稱凝血因子III，是外源性凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)因子，是人體內(nèi)活性最強(qiáng)的促凝物質(zhì)之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)TF除了在正常生理狀態(tài)下表現(xiàn)的功能外，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。TF的過(guò)度表達(dá)經(jīng)常被與腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，TF在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞比在非轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞表達(dá)水平可高達(dá)1000倍以上，提示TF在腫瘤轉(zhuǎn)移的直接作用。目前已知的TF在人腦膠質(zhì)瘤、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、大腸癌、胰腺癌等癌癥細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)。腫瘤細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)的TF與腫瘤的血管生成、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲以及腫瘤患者預(yù)后等有密切關(guān)聯(lián)。根據(jù)TF在腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管細(xì)胞表面的高表達(dá)狀態(tài)，其作為腫瘤分子靶向治療的靶點(diǎn)已經(jīng)收到了廣泛關(guān)注。目前有關(guān)TF及其配體FVE的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VE上類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子 I 區(qū)多肽(First epidermal growth factor-likedomain, EGFl)是與 TF 結(jié)合的重要配體，該肽段具有結(jié)合TF功能而無(wú)促凝活性，因此EGFl肽可基于配/受體的相互作用而成為靶向TF制劑的導(dǎo)向功能基。
[0006]目前已有很多研究以FVE突變體(其中氨基酸突變)作為靶向功能基修飾于載藥納米顆粒表面或者與細(xì)胞免疫蛋白融合表達(dá)，靶向癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的組織因子，從而達(dá)到治療的目的。另外也有以EGFl作為靶向多肽，修飾于紫杉醇納米顆粒表面用于腦膠質(zhì)瘤的治療。但是EGFl-多系紫杉醇納米載藥顆粒的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本專(zhuān)利是在該方面的創(chuàng)新，制備了一種新穎的革E向納米載藥顆粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供通過(guò)超聲乳化/溶劑揮發(fā)法，構(gòu)建針對(duì)藥物包裹多西紫杉醇的納米載藥系統(tǒng)，解決多西紫杉醇水溶性、緩釋性、吸收性、存在的問(wèn)題，同時(shí)在該納米顆粒表面修飾一種靶向性多肽，直接靶向腫瘤細(xì)胞，提高對(duì)腫瘤的治療效果。
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種多西紫杉醇納米載藥顆粒，其包括納米顆粒、包裹在所述的納米顆粒內(nèi)的多西紫杉醇、通過(guò)共價(jià)鍵修飾于所述的納米顆粒表面的巰基化的EGFl蛋白，所述的納米顆粒是由馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙醇酸聚合物形成。
[0009]具體地，所述的馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙醇酸聚合物中的馬來(lái)酰亞胺基與所述的巰基化的EGFl蛋白中的巰基形成所述的共價(jià)鍵。
[0010]一種所述的多西紫杉醇納米載藥顆粒的制備方法，包括依次進(jìn)行的如下步驟: 步驟(I )、采用揮發(fā)性有機(jī)溶劑將所述的馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙醇酸聚合物與所述的多西紫杉醇溶解，得到有機(jī)相，而后在超聲乳化儀超聲的條件下將所述的有機(jī)相分散至水相中，得到水包油型乳液，攪拌使所述的有機(jī)溶劑揮發(fā)，得到納米顆粒，離心后制得包裹有多西紫杉醇的納米顆粒；
步驟(2)、將步驟(I)制得的包裹有多西紫杉醇的納米顆粒與所述的巰基化的EGFl蛋白在孵育條件下以所述的共價(jià)鍵連接，制得所述的多西紫杉醇納米載藥顆粒。
[0011]具體地，所述的揮發(fā)性有機(jī)溶劑為二氯甲烷，所述的水相為質(zhì)量濃度為0.5wt%~2wt%的聚乙烯醇水溶液，所述有機(jī)相與水相的體積之比為15~25:1。
[0012]具體地，所述的馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙醇酸聚合物與所述的多西紫杉醇的投料質(zhì)量比為40~60:1。
[0013]具體地，步驟(I)中還包括在離心操作后，采用超純水將包裹有多西紫杉醇的納米顆粒洗滌干凈、凍干的步驟。
[0014]具體地，步驟(2)中，所述的包裹有多西紫杉醇的納米顆粒中的馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙醇酸聚合物與所述的巰基化的EGFl蛋白中的巰基的投料摩爾比為
1: 0.5?1.5o
[0015]具體地，步驟(2)的【具體實(shí)施方式】為:將所述的包裹有多西紫杉醇的納米顆粒加入到磷酸鹽緩沖液中，混勻后，加入所述的巰基化的EGFl蛋白，在10~35°C下避光、充氮?dú)獾那闆r下磁力攪拌10~16小時(shí)，然后在2~6°C、13500~14500rpm的條件離心，除去上清液后，加入磷酸鹽緩沖液混勻，經(jīng)Sepharose CL-4B柱，除去未結(jié)合的游離蛋白，收集洗脫液，所述的洗脫液經(jīng)冷凍干燥得到所述的多西紫杉醇納米載藥顆粒。
[0016]更具體地，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為0.008-0.012mol/Lo
[0017]—種所述的多西紫杉醇納米載藥顆粒在制備治療過(guò)度表達(dá)組織因子的腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0018]優(yōu)選地，一種所述的多西紫杉醇納米載藥顆粒在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0019]由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn):采用簡(jiǎn)單易行的超聲乳化溶劑揮發(fā)法制備納米載藥顆粒，該方法成本低廉，可重復(fù)性好，不需要超潔凈實(shí)驗(yàn)環(huán)境，并可以大批量制備，具有操作方便、簡(jiǎn)單易行、成本低廉以及可重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，這些優(yōu)勢(shì)可被廣泛應(yīng)用于多種疏水性藥物的納米載藥顆粒制備。同時(shí)在制備的納米顆粒表面修飾靶向性多肽，能夠主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞，且與組織因子的胞外區(qū)具有較高的親和力，不會(huì)引起凝血效應(yīng)，提高藥物在腫瘤部位的濃度，降低藥物的毒性，生物安全性良好，且能有效延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間，有效地提高多西紫杉醇的生物利用度，提供了一種新穎的腫瘤靶向藥物治療方式。
【附圖說(shuō)明】
[0020]附圖1為多西紫杉醇納米載藥顆粒的制備流程示意圖；
附圖2為EGFl蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定的SDS-PAGE電泳圖，其中:M:Marker;帶I為誘導(dǎo)后工程菌BL21;帶2為未誘導(dǎo)菌；帶3，4為純化后洗脫液；
附圖3為包裹有多西紫杉醇的納米顆粒的粒徑分布圖；
附圖4為多西紫杉醇納米載藥顆粒的粒徑分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案作進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中所采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。以下實(shí)施例中表示含量的百分比“ ％”均指的是質(zhì)量百分含量。
[0022]實(shí)施例1:包裹多西紫杉醇的的納米顆粒的制備包括以下步驟:
I)稱取Img多西紫杉醇和50mg的馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙醇酸聚合物(Malemide-PEG-PLGA)溶于Iml二氯甲烷，振蕩使其充分溶解，得到有機(jī)相。
[0023])在冰浴超聲的條件下，在持續(xù)超聲90s內(nèi)將有機(jī)相用注射器緩慢均勻的加入到20ml的1%聚乙烯醇水溶液中，繼續(xù)設(shè)置超聲12min (參數(shù)設(shè)置，功率為300w，Is開(kāi)Is關(guān))得到0/W型乳液。
[0024])保鮮膜扎孔封口，磁力攪拌10h，使二氯甲烷緩慢的揮發(fā)，納米顆粒均勻的固化。
[0025])將納米顆?；鞈乙哼M(jìn)行高速離心(儀器參數(shù)設(shè)置:16000rpm，25°C，60min),將上清液傾倒出，得到包裹多西紫杉醇的的納米顆粒。
[0026])超純水洗滌包裹多西紫杉醇的的納米顆粒，除去游離的藥物，取部分添加5%(w/v)蔗糖作為凍干保護(hù)劑混合均勻，于冷凍干燥機(jī)中凍