水楊酸在制備抑制木糖葡萄球菌生物被膜藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水楊酸新醫(yī)藥用途，尤其涉及水楊酸在制備抑制木糖葡萄球菌或干預(yù) 木糖葡萄球菌生物被膜的藥物中的應(yīng)用，屬于水楊酸新醫(yī)藥用途領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 木糖葡萄球菌是一種血漿凝固酶陰性葡萄球菌（CNS)。此菌廣泛分布于自然界， 以往認(rèn)為是非致病菌。近幾年，血漿凝固酶陰性葡萄球菌被認(rèn)為是形成奶牛乳房炎的新興 病原菌。奶牛乳房炎是對(duì)奶業(yè)危害十分嚴(yán)重的疾病之一，也是導(dǎo)致奶牛淘汰的第三大疾 病。引起奶牛乳房炎不易治愈和反復(fù)發(fā)作的最有說(shuō)服力的說(shuō)法就是其有很強(qiáng)的生物被膜 (Biofilm，BF)形成能力。生物被膜是細(xì)菌產(chǎn)生的多聚復(fù)合物基質(zhì)將自身包繞，黏附于無(wú) 活性物體或活體表面，形成的有一定結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群體；它可以抵抗宿主免疫力和抗生素抑 菌殺菌作用；生物被膜內(nèi)細(xì)菌容易對(duì)抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性，造成感染難以治愈，反復(fù)發(fā) 作。
[0003] 生物被膜狀態(tài)的細(xì)菌與浮游態(tài)的細(xì)菌在組成結(jié)構(gòu)、生理特性、耐藥性等方面差異 較大，生物被膜狀態(tài)的細(xì)菌對(duì)抗生素及宿主的免疫反應(yīng)是不敏感的，生物被膜狀態(tài)的細(xì)菌 對(duì)抗菌劑的耐藥性是一個(gè)多因素過(guò)程，主要是生物被膜中細(xì)菌與其浮游態(tài)在生理性上有所 不同。生物被膜形成后細(xì)菌可表達(dá)出獨(dú)特的、不同于浮游菌的生物被膜表型，表達(dá)獨(dú)特的 抗性基因。由于細(xì)菌生物被膜的耐藥機(jī)制完全不同于浮游菌，能夠抑制浮游態(tài)的細(xì)菌的抗 菌藥物不一定能夠干預(yù)或抑制細(xì)菌生物被膜；臨床上發(fā)現(xiàn)即使反復(fù)試驗(yàn)證明有效的藥物， 但也不能清除生物被膜，導(dǎo)致感染迀延不愈，浪費(fèi)了大量的人力及物力，形成了公共衛(wèi)生問(wèn) 題。
[0004] 水楊酸是植物柳樹(shù)皮提取物，是一種天然的消炎藥。水楊酸能夠抑制表皮葡萄球 菌，金黃色葡萄球菌等細(xì)菌生物被膜的形成，減小它們的毒性和黏附性。并且通過(guò)與高分子 聚合物結(jié)合控制水楊酸的釋放度可以很好的抑制生物被膜的形成。水楊酸也可以抑制群體 感應(yīng)系統(tǒng)。迄今為止，未見(jiàn)水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜具有干預(yù)或抑制作用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供水楊酸在制備抑制木糖葡萄球菌或干預(yù)木糖葡 萄球菌生物被膜藥物上的新用途。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明通過(guò)體外建立木糖葡萄球菌生物被膜，通過(guò)結(jié)晶紫法、XTT法和激光共聚焦 顯微鏡考察水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用。
[0008] 通過(guò)結(jié)晶紫法研究了不同藥物濃度下水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作 用，結(jié)果表明各個(gè)濃度藥物的OD值隨著藥物濃度的增大而減小，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。每個(gè)濃度的 OD值與空白對(duì)照存在顯著性差異。甲醇對(duì)照組和菌液對(duì)照組的OD值之間，沒(méi)有顯著性差 異，說(shuō)明水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌的生物被膜有確切的干預(yù)作用。
[0009] 通過(guò)XTT法和激光共聚焦顯微鏡觀察了不同藥物濃度下水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌 的細(xì)菌活性的影響：XTT法結(jié)果表明隨著水楊酸藥物濃度的加大，抑菌率不斷變大，當(dāng)濃度 達(dá)到1/2MIC時(shí)，水楊酸對(duì)生物被膜里的活菌有很好的抑制殺滅作用；通過(guò)激光共聚焦顯微 鏡觀察，在沒(méi)有加藥的情況下生物被膜形成較厚。而當(dāng)水楊酸藥物濃度達(dá)到1/2MIC時(shí)，生 物被膜明顯變薄，細(xì)菌活力呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明在水楊酸藥物的作用下，藥物可以滲透生物被 膜作用到內(nèi)部，生物被膜內(nèi)的木糖葡萄球菌明顯受到抑制。
[0010] 綜上所述，水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌有殺菌作用并且對(duì)生物被膜有很好的干預(yù)或抑 制作用。因此，水楊酸可以用于制備抑制木糖葡萄球菌的藥物。
[0011] 本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制木糖葡萄球菌的藥物組合物，包括：預(yù)防或治療上有效量 的水楊酸和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
[0012] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種抑制木糖葡萄球菌生物被膜的藥物組合物，包括：預(yù)防或治 療上有效量的水楊酸和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
[0013] 所述的抑制木糖葡萄球菌生物被膜包括干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜的形成或抑 制成熟的木糖葡萄球菌生物被膜的木糖葡萄球菌。
[0014] 所述的載體或輔料是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的載體或輔料，例如：稀釋劑、崩裂劑、潤(rùn)滑 劑、賦形劑、粘合劑、助流劑、填充劑、表面活性劑等；另外，還可以在組合物中加入其它輔助 劑如香味劑和甜味劑。
[0015] 所述稀釋劑可以是一種或幾種增加片劑重量和體積的成分；常用的稀釋劑包括乳 糖、淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、山梨醇、甘露醇以及無(wú)機(jī)鈣鹽等。其中最常用為乳糖、淀 粉、微晶纖維素。
[0016] 所述崩解劑可以為交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（與總重量比為2 - 6% )，交聯(lián)羧甲基纖 維素鈉（與總重量比為2 - 6% )、海藻酸（與總重量比為2 - 5% )、微晶纖維素（與總重 量比為5 - 15% )中之一種或幾種混合物。其中以交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（與總重量比為 2 - 7%)，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（與總重量比為2 - 6%)為佳。最佳為交聯(lián)聚乙烯吡咯 烷酮（與總重量比為2 - 6%)。
[0017] 所述的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，聚乙二醇，滑石粉，氫 化植物油中之一種或幾種混合物。其中以硬脂酸鎂最為適宜。潤(rùn)滑劑的用量范圍（與總重 量比）為0.10 - 1%，一般用量為0.25 - 0.75%，最佳用量為0.5 - 0.7%。
[0018] 所述的粘合劑可以是一種或幾種有利于制粒的成分?？梢允堑矸蹪{（10 - 30%， 與粘合劑總重量比），羥丙基甲基纖維素（2-5%，與粘合劑總重量比），聚乙烯吡咯烷酮 (2-20%，與粘合劑總重量比），以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液為佳，最佳為聚乙烯吡咯烷 酮的50 %乙醇水溶液。
[0019] 所述助流劑可以為微粉硅膠、滑石粉、三硅酸鎂中之一種或幾種混合物。
[0020] 所述表面活性劑可以為一種或幾種能夠提高潤(rùn)濕性和增加藥物溶出的成分。常用 為十二烷基硫酸鈉（常用范圍為0. 2 - 6%，與總重量比）。
[0021 ] 水楊酸，別名為：2-羥基苯甲酸、柳酸、鄰羥基苯甲酸、升華水楊酸、鄰-羥基苯甲 酸，植物柳樹(shù)皮提取物，是一種天然的消炎藥。其分子式為C7H6O3，分子量為138. 12,分子結(jié) 構(gòu)⑴如下：
[0022]
[0023] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比有以下有益效果：
[0024] 本發(fā)明水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜具有顯著的抑制作用，能有效的干預(yù)木糖 葡萄球菌生物被膜的形成并殺滅成熟生物被膜內(nèi)的木糖葡萄球菌，能應(yīng)用于制備抑制木糖 葡萄球菌或干預(yù)木糖葡萄球菌生物被膜形成的藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為不同藥物濃度下水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用。
[0026] 圖2為不同藥物濃度下水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌的抑菌率。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。本領(lǐng)域技 術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形 式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0028] 1、材料
[0029] I. 1實(shí)驗(yàn)菌株
[0030] 木糖葡萄球菌ATCC700404購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心。
[0031] 1.2 試劑
[0032] 生理鹽水購(gòu)于哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司
[0033] 甲醇購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司
[0034] TSB培養(yǎng)基購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司
[0035] XTT試劑盒購(gòu)于凱基生物科技發(fā)展有限公司
[0036]Live/dead試劑盒購(gòu)于MolecularProbes
[0037]I. 3主要試劑的配制
[0038] TSB液體培養(yǎng)基：稱取4. 5g培養(yǎng)基，加入200毫升蒸餾水，高壓蒸汽滅菌。
[0039] 99%甲醇溶液：1ml水加入99ml100%的甲醇，混勻。
[0040] 0. 1 %結(jié)晶紫溶液：稱取結(jié)晶紫0.lg，加入100mL蒸餾水，混勻。
[0041] 33%冰醋酸溶液：量取33ml的冰醋酸，加入67ml的蒸餾水，混勻。
[0042] L4實(shí)驗(yàn)儀器
[0043] 高壓滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）
[0044] DH6000A電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）
[0045] 超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）
[0046]XK96-A快速混勻器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）
[0047] 96孔板（美國(guó)Corning公司）
[0048] 6孔板（美國(guó)Corning公司）
[0049] 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司TD2002A)
[0050] 酶標(biāo)儀（美國(guó)Epoch公司）
[0051] 激光共聚焦掃描電鏡（萊卡Laica公司）
[0052] 實(shí)驗(yàn)例1水楊酸對(duì)木糖葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用
[0053] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0054] I. 1藥物的配制
[0055] 精密稱取水楊酸I. 〇〇g，溶于IOmL甲醇中，配成濃