氫氣飽和生理鹽水的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及氫氣飽和生理鹽水的新用途，具體地說，是氫氣飽和生理鹽水在制備穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]動脈粥樣硬化(AS)是一個穩(wěn)定期與不穩(wěn)定期交替的非線性過程，這一過程取決于斑塊的穩(wěn)定性和易損性。相較于斑塊的早期形成，對斑塊穩(wěn)定性的研究越來越受到人們的重視。AS晚期不穩(wěn)定斑塊(易損斑塊)的破裂是引起急性冠脈綜合征、急性腦梗死等心腦血管病急癥的主要原因。而不穩(wěn)定斑塊的特征是:大的細胞外脂質池、薄的纖維帽、巨噬細胞和T淋巴細胞的浸潤等。大量細胞凋亡尤其巨噬細胞凋亡是導致易損斑塊形成，影響其穩(wěn)定性的重要因素。在AS進展過程中，巨噬細胞凋亡不僅直接導致凋亡的平滑肌細胞和巨噬細胞不能被有效吞噬，促進脂質核心的形成及增大，而且富含游離膽固醇的凋亡巨噬細胞通過釋放基質降解蛋白酶損傷纖維帽，并產生腫瘤壞死因子-α、白介素-1 β，引起繼發(fā)性炎癥反應和壞死，從而促進斑塊不穩(wěn)定。因此目前認為干預巨噬細胞凋亡過程可能對阻止AS進展、阻止已形成的斑塊破裂、降低心腦血管病事件發(fā)生率具有重要意義。
[0003]大部分生物學家一直認為，氫氣屬于生理性惰性氣體。最近的研究發(fā)現(xiàn)，氫氣不僅不是生理性惰性氣體，而是一種良好的選擇性抗氧化物質，對許多疾病具有顯著治療作用。2007年7月，1.0hsawa等在《自然醫(yī)學》報道，動物吸入2%的氫氣，可清除自由基，改善腦缺血再灌注損傷，作用基礎是氫氣可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子。該研究迅速引起廣泛關注，并引起了研究氫氣治療疾病的熱潮。隨后，有人又用肝和心肌缺血動物模型，證明呼吸2 %的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷。采用飲用飽和氫氣水可治療應激引起的神經損傷、人類2型糖尿病、小鼠基因缺陷慢性氧化應激損傷、化療藥順鉑引起的腎損傷和帕金森病。呼吸2%的氫氣可治療小腸移植引起的炎癥損傷，對小腸缺血和心臟移植后損傷同樣具有保護作用。上海第二軍醫(yī)大的研究報道呼吸2%的氫氣可治療新生兒腦缺血缺氧損傷。申請人的研究證實，腹腔注射飽和氫氣生理鹽水能夠降低倉鼠血漿低密度脂蛋白膽固醇水平并改善高密度脂蛋白功能。上述研究表明，作為選擇性抗氧化物質，氫氣對很多疾病具有治療作用，具有十分廣泛的應用前景。申請人發(fā)表在”動脈粥樣硬化(Atherosclerosis) ”雜志上的科學發(fā)現(xiàn)和日本學者Ohsawa等的報道均表明:氫分子在載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)鼠模型中具有明確的抗早期AS作用，能抑制AS斑塊處的炎癥反應和巨噬細胞聚集，但氫氣分子是否能影響已形成的晚期動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性仍未闡明。鑒于氫氣的抗凋亡特性，本申請利用與人脂質譜接近的低密度脂蛋白受體敲除(LDLR7 )小鼠，研究了氫氣對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及對斑塊處巨噬細胞凋亡的影響。
[0004]中國專利公開號CN101347451A公開了一種具有治療缺血再灌注損傷功能的含氫注射液，該發(fā)明是一種可用于治療腦、心、腎等組織器官缺血再灌注損傷的注射液。制備方法為:將醫(yī)用注射液軟包裝袋置于低壓下脫氣處理，抽除氣體后進行低溫預處理，再注入氫氣進行加壓助溶，使氫氣溶于注射液，在常壓4°C左右保存?zhèn)溆?，穩(wěn)定24小時后就可使用。但是關于氫氣飽和生理鹽水在制備穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊藥物中的應用目前還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明針對以上不足之處，提供了一種氫氣飽和生理鹽水的新用途，氫氣飽和生理鹽水通過減少斑塊內脂質和巨噬細胞含量及炎癥反應，增加斑塊內膠原含量，從而增加斑塊穩(wěn)定得分，防止其破裂。
[0006]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:一種氫氣飽和生理鹽水的應用，氫氣飽和生理鹽水在制備穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊藥物中的應用。
[0007]氫氣飽和生理鹽水在制備穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊保健品中的應用。
[0008]所述氫氣飽和生理鹽水的制備方法為:生理鹽水在0.5 MPa壓力下加壓暴露4h,將純氫氣溶解于無菌生理鹽水中達到飽和水平，4°C貯存于移除氣體的密封生理鹽水袋中備用。
[0009]所述氫氣飽和生理鹽水維持氫氣濃度不低于0.6 mM，一周內配制使用均可達到此濃度。
[0010]本發(fā)明優(yōu)點在于:提供了氫氣飽和生理鹽水的新用途，首次揭示了氫氣飽和生理鹽水除抑制動脈粥樣硬化斑塊形成外，還可使其穩(wěn)定，不易破裂；氫生理鹽水制備簡單、注射濃度高、使用方便且無爆炸風險，成本很低，且無副作用，從動物實驗的結果來看具有良好的治療優(yōu)勢，大大減少易損斑塊患者藥物副作用風險，并大大降低醫(yī)療成本。
【附圖說明】
[0011 ] 圖1所示為:主動脈斑塊病變分析結果；
圖2所示為:斑塊穩(wěn)定得分；
圖3所示為:主動脈斑塊MMP-9免疫熒光組織化學分析結果；
圖4所示為:主動脈斑塊⑶83和FoxP3免疫熒光組織化學分析結果；
圖5所示為:實時熒光定量PCR結果；
圖6所示為:TUNEL染色結果；
圖7所示為:免疫印跡；
圖8所示為:主動脈斑塊BIP和CHOP免疫熒光組織化學分析。
【具體實施方式】
[0012]下面結合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0013]材料和方法
1.1動物和實驗設計
80只8-9周齡雄性LDLR7小鼠隨機分成5組，每組16只。分別為:
陰性對照組(溶媒組，Control),
飽和氫氣生理鹽水低劑量組(0.5 ml/kg/d, H2-L),
飽和氫氣生理鹽水高劑量組(5 ml/kg/d, H2-H)、
陽性對照辛伐他汀組(5 mg/kg/d, Sim (5))、
聯(lián)合用藥組(低劑量氫氣和2.5 mg/kg/d辛伐他汀，H2-L + Sim (2.5))。
[0014]適應性喂養(yǎng)I周后，給予尚脂(15.8%)、尚膽固醇(1.25%)飲食，自由飲水。氣氣生理鹽水腹腔注射給藥，辛伐他汀灌胃給藥，持續(xù)28周。
[0015]氫氣飽和生理鹽水的制備
在0.5 MPa壓力下加壓暴露4 h,將純氫氣溶解于正常無菌生理鹽水中達到飽和水平，4°C貯存于移除氣體的密封生理鹽水袋中。所用氫氣飽和生理鹽水均為I周內配置，以維持氫氣濃度不低于0.6 mM。
[0016]病變分析
主動脈根部靠近心底的部位用于連續(xù)冰凍切片的制作。冰凍切片的厚度為8 μπι，切片開始的部位為主動脈根部主動脈瓣開始出現(xiàn)處，每間隔16 μm收集一張切片，直至主動脈瓣膜完全消失。分別采用不連續(xù)切片的油紅O染色和Trichrome染色(Sigma, HT15)確定斑塊脂質核心和膠原面積；利用抗SMC抗體