免疫調(diào)節(jié)分子Rhbdd3的抗炎作用及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及含有rhomboid結(jié)構(gòu)域的 蛋白3(rhomboid domain containing3，Rhbdd3)在預(yù)防或治療與樹(shù)突狀細(xì)胞活化狀態(tài)相關(guān) 的疾病或癥狀、治療或預(yù)防感染和感染導(dǎo)致的炎癥性疾病、控制炎癥損傷中的效應(yīng)、作用機(jī) 制、實(shí)施方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 感染是一種危害極大的臨床常見(jiàn)疾病，可以導(dǎo)致機(jī)體局部和全身的感染性表 現(xiàn)，甚至可以最終導(dǎo)致感染性休克、內(nèi)毒素性休克以及多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等嚴(yán)重后果，一旦重度感染導(dǎo)致出現(xiàn)休克或者多器官 功能衰竭，則引起高死亡率（~50-80%)表現(xiàn)。常見(jiàn)的臨床細(xì)菌感染，如大腸埃希菌、銅綠 假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、糞腸球菌等均可以導(dǎo)致機(jī)體局 部和全身的炎癥反應(yīng)，引起不同程度的感染性疾病的發(fā)生。
[0003] 對(duì)于細(xì)菌感染患者，醫(yī)生一般采用大劑量抗生素"轟炸"，意欲"一舉殲敵"，快速、 徹底清除病原體，但是往往忽略了另一方面，即在病菌死亡后會(huì)釋放大量毒素，而這些毒素 能夠引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性癥狀。誘發(fā)全身性炎癥的毒素主要有兩類(lèi)：內(nèi)毒素（革蘭氏陰性細(xì) 菌細(xì)胞壁的脂多糖成分）和超抗原（包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的肽聚糖/脂磷壁復(fù)合物、外毒 素等毒素）。目前細(xì)菌感染導(dǎo)致的休克和多器官功能衰竭仍然是臨床預(yù)防和治療的重大挑 戰(zhàn)。
[0004] 人們對(duì)于機(jī)體識(shí)別外來(lái)微生物的分子機(jī)制并不完全了解，但是隨著Toll樣分子 的發(fā)現(xiàn)，機(jī)體針對(duì)微生物所產(chǎn)生的天然免疫和繼發(fā)的獲得性免疫的細(xì)胞和分子生物學(xué)基礎(chǔ) 逐步得到了認(rèn)識(shí)。Toll蛋白最早發(fā)現(xiàn)在果蠅胚胎發(fā)育過(guò)程中，對(duì)背腹側(cè)體軸細(xì)胞的形成起 重要調(diào)控作用【Hashimoto, C?等，Cell. 1988 ;52:269-279 ;Anderson，K. V?等，Cell. 1985 ; 42:791-798】。Toll蛋白在物種進(jìn)化上高度保守，目前為止在哺乳動(dòng)物相繼發(fā)現(xiàn)了13種 Toll樣受體（Toll-like代。6卩1:〇^，1'1^8)【]\16(1211；[1:0￥，1?.等，似1：11代.1997;388:394-397; Rock，F(xiàn). L?等，Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:588-593】。
[0005] 不同的TLR識(shí)別不同病原體中相應(yīng)的特定分子結(jié)構(gòu)或特征，這些分子是一類(lèi)大多 數(shù)病原微生物所共有的組成性表達(dá)分子，結(jié)構(gòu)保守，稱(chēng)為病原體相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs);而相應(yīng)的受體則為模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors, PRRs)。天然免疫系統(tǒng)通過(guò)PRR識(shí)別病原體保守的PAMP，誘導(dǎo)抗 病原體天然免疫應(yīng)答，構(gòu)成機(jī)體抗感染的第一道防線，同時(shí)對(duì)獲得性免疫也具有重要的調(diào) 控作用。
[0006] TLR是一類(lèi)模式識(shí)別受體，廣泛分布于免疫細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表 面，可以通過(guò)病原微生物特定的病原體相關(guān)分子模式識(shí)別抗原并激活相應(yīng)的信號(hào)通路， 啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，構(gòu)成機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道防線。TLRs是I型跨膜蛋 白，屬于TIR(Toll/IL-lreceptor)超家族成員。TLR受體與相應(yīng)配體結(jié)合可以分別 活化下游的MyD88(myeloiddifferentiationfactor88)依賴(lài)性通路和TRIF(Toll/IL-Ireceptor(TIR)-domaincontainingadaptorproteininducingIFN-3 )依賴(lài)性通 路，MyD88既而活化下游的IRAKs、TRAF6、TAKl及IKK和MPK等信號(hào)分子，最終導(dǎo)致NF-KB 和APl的早期活化，介導(dǎo)炎癥因子如IL-6、TNFa、IL-12和一氧化氮的產(chǎn)生；TRIF的活化能 激活TBKl、TRAF3和IRF3,最終導(dǎo)致I型干擾素的產(chǎn)生和干擾素誘導(dǎo)基因的活化，如CXCLlO 和CCL5 等【Akira，S?等，Nat.Rev.Immunol. 4,499-511(2004) ;Liew，F(xiàn).Y?等，Nat.Rev. Immunol. 5,446-458(2005)】。
[0007] 人類(lèi)TLR1、TLR2、TLR3和TLR6定位于4號(hào)染色體，其中TLR2識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌 成分細(xì)菌脂蛋白BLP等成分，并與TLR6協(xié)同作用識(shí)別PGN分子等，TLR3則識(shí)別病毒分子中 雙鏈 RNA(double-stranded RNA，dsRNA)【Takeuchi，0?等，Immunity. 1999 ;11:443-451 ; Ozinsky，A?等，Proc Natl Acad Sci USA. 2000 ;97:13766-13771 ;Alexopoulou，L?等， Nature. 2001 ;413:732-738】。人類(lèi)TLR4和TLR5分別定位于9和1號(hào)染色體，相應(yīng)識(shí) 別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)和細(xì)菌鞭毛蛋白分子 flagelin【Poltorak A?等，Science. 1998 ;282:2085_2088 ;Hayashi F?等，Nature. 2001 ; 410:1099-1103】；人類(lèi)TLR7和TLR8基因定位于染色體Xp22，識(shí)別病毒分子中的單鏈 RNA(single-stranded RNA，ssRNAs)【Heil，F(xiàn)?等，Science. 2004;303:1526-1529】；人類(lèi) TLR9定位于染色體3p21. 3,識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的CpG寡核昔 酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG 0DN)【Hemmi，H?等，Nature. 2000 ;408:740_745】； TLRll為T(mén)LRs家族新成員，主要表達(dá)于泌尿系統(tǒng)，在控制泌尿系統(tǒng)細(xì)菌感染的過(guò)程中發(fā)揮 重要作用【Zhang D?等，Science. 2004;303:1522-1526】。
[0008] 目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR不僅與機(jī)體的抗感染免疫密切相關(guān)，而且與很多種疾病的發(fā) 生和進(jìn)展具有因果關(guān)系。微生物在進(jìn)入機(jī)體后可以快速激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，由樹(shù)突 狀細(xì)胞（dendritic cells，DC)、巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生大量的炎 癥因子（如IL-6、TNF a、IL-12和IL-15等），一方面直接殺死和消除外來(lái)病原體，一方面 誘導(dǎo)針對(duì)病原體的特異性獲得性免疫。如果機(jī)體不能夠及時(shí)有效地清除病原體，則會(huì)引起 機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的紊亂，導(dǎo)致慢性炎癥，甚至可以引起繼發(fā)的多種臨床慢性炎癥性疾病 (如結(jié)核病、慢性肝炎、慢性腎炎以及慢性胃腸道疾?。綜 〇〇k，D. N.等，Nat. Immunol. 2004， 5:975-979】。
[0009] 雖然TLR信號(hào)通路作為機(jī)體固有免疫的第一道屏障，通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子和干 擾素來(lái)清除病原體，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是TLRs的活化是一把雙刃劍，TLR信號(hào)的過(guò) 度活化、特別是NF-K B信號(hào)途徑紊亂及過(guò)多的炎癥因子產(chǎn)生，自身免疫性免疫細(xì)胞或分子 對(duì)自身細(xì)胞或組織進(jìn)行持續(xù)的免疫攻擊與急性和慢性炎癥、自身免疫性疾病、中毒性休克 等多種疾病相關(guān)，這些疾病是嚴(yán)重影響我國(guó)國(guó)民健康和生存質(zhì)量的緊迫問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)， 多種自身免疫病、過(guò)敏性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、甚至包括多種腫瘤均與慢性炎癥密切相關(guān)， 其發(fā)病機(jī)制涉及TLRs的信號(hào)傳導(dǎo)異常及其引發(fā)的樹(shù)突狀細(xì)胞的過(guò)度活化【Cook，D.N.等， Nat. Immunol. 2004,5:975-979】。炎癥性疾病如內(nèi)毒素休克的機(jī)理是由于病灶或血流中革 蘭氏陰性病原菌大量死亡，釋放出來(lái)的大量?jī)?nèi)毒素進(jìn)入血液時(shí)，可發(fā)生內(nèi)毒素血癥。大量?jī)?nèi) 毒素作用于機(jī)體的樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板，以及補(bǔ)體系統(tǒng)和 凝血系統(tǒng)等，便會(huì)產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8和TNFa、組胺、5羥色胺、前列腺素、激肽等生物活 性物質(zhì)。這些物質(zhì)作用于小血管造成功能紊亂而導(dǎo)致微循環(huán)障礙，臨床表現(xiàn)為微循環(huán)衰竭、 低血壓、缺氧、酸中毒等，進(jìn)而導(dǎo)致休克，嚴(yán)重者可致死亡。其本質(zhì)是大量生物毒素引發(fā)的機(jī) 體過(guò)度的炎性反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體自身的損傷，在此過(guò)程中，免疫細(xì)胞表面的TLRs介導(dǎo)的炎性反 應(yīng)是其致病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。因此，TLR信號(hào)通路的活化必須受到嚴(yán)格的調(diào)控，防止其過(guò)度 活化，尤其是炎癥因子的過(guò)度產(chǎn)生。
[0010] 目前的研究表明很多跨膜和胞內(nèi)分子都能夠負(fù)調(diào)節(jié)TLR信號(hào)通路，抑制MyD88依 賴(lài)性通路的活化和炎癥因子的產(chǎn)生，如A20、CYLD、DUBA、SHP-I等，還有某些分子通過(guò)減 少細(xì)胞膜表面TLRs受體的表達(dá)來(lái)達(dá)到負(fù)調(diào)節(jié)的目的【Akira, S.等，Nat. Rev. Immunol. 4， 499-511(2004) ;Liew，F(xiàn). Y?等，Nat.Rev.Immunol.5,446-458(2005)】。這些負(fù)調(diào)分子的 缺失將導(dǎo)致TLR觸發(fā)的免疫與炎癥反應(yīng)過(guò)度活化，如A20分子缺陷導(dǎo)致小鼠對(duì)內(nèi)毒素休 克敏感性增加、并自發(fā)產(chǎn)生自身免疫性疾病【Hammer，G.E.等，Nat. Immunol. 2011 ;12， 1184-1193】。針對(duì)TLR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行的研究和試驗(yàn)已經(jīng)表明，抑制TLR信號(hào)傳 導(dǎo)的各個(gè)環(huán)節(jié)可以有效地控制細(xì)菌感染所導(dǎo)致的炎癥性反應(yīng)，預(yù)防和治療細(xì)菌感染導(dǎo)致的 休克、器官功能損傷等嚴(yán)重的后果。已有研究發(fā)現(xiàn)TLR拮抗劑可以應(yīng)用于感染性疾病的預(yù) 防和治療，如TLR4拮抗劑TAK-242、E5564等可以應(yīng)用于嚴(yán)重的敗血癥（III期臨床試驗(yàn)） 【Liew，F(xiàn). Y?等，Nat. Rev. Immunol. 2005 ；5,446-458 ；Cook, D. N.等，Natlmmunol. 2004 ； 5:975-979】。
[0011] 樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC)廣泛存在于胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等淋巴器官以 及幾乎所有非淋巴組織和器官中。DC是機(jī)體功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，能激活初始、記 憶性及效應(yīng)性T細(xì)胞，是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的核心橋梁，在激活免疫應(yīng)答以及維 持免疫耐受中起著關(guān)鍵作用【Medzhitov，R. Nature. 2007 ;449,819-826】。DC通過(guò)其表達(dá) 的TLR等模式識(shí)別受體識(shí)別抗原，對(duì)機(jī)體中的病原體來(lái)源的或自身成分來(lái)源的危險(xiǎn)因素迅 速做出應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥因子包括IL_6、TNFa及I型干擾素產(chǎn)生。此外，未成熟DC在上述危 險(xiǎn)信號(hào)刺激下能上調(diào)表面活化標(biāo)志包括⑶40、⑶80、⑶86以及主要組織相容性復(fù)合體II類(lèi) 分子I-A b,經(jīng)歷成熟、分化，啟動(dòng)并調(diào)控天然免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和方向【Ganguly, D.等，Nat. Rev. Immunol. 2013 ;13, 566-577】。樹(shù)突狀細(xì)胞同時(shí)還能通過(guò)其表面分子以及分泌的細(xì)胞因 子影響T細(xì)胞亞群，特別是輔助性T細(xì)胞Thl7細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）分化，從 而調(diào)控適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
[0012] 樹(shù)突狀細(xì)胞功能過(guò)度活化被證實(shí)與多種感染性疾病、移植排斥、過(guò)敏性疾病、自 身免疫性疾病密切相關(guān)，越來(lái)越多地成為相關(guān)疾病的干預(yù)或治療靶點(diǎn)。而DC對(duì)CD4 +T細(xì) 胞及CD8+T細(xì)胞的刺激作用使得DC疫苗廣泛應(yīng)用于慢性感染性疾病及腫瘤的預(yù)防和治 療【Lipscomb, M.F.等，Physiol. Rev. 2002 ;82,97-130】。DC 過(guò)度分泌的 IL-6 能通過(guò)擾亂 Treg/Thl7平衡而引發(fā)持續(xù)有害的免疫病理?yè)p傷，導(dǎo)致自身免疫性疾?。ㄈ缍喟l(fā)性硬化及 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）的發(fā)生，而阻斷IL-6信號(hào)通路已經(jīng)成