一種獸用疫苗及其制備方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑，特別涉及一種獸用疫苗及其制備方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 兔瘟又稱兔病毒性出血癥（RHD)，是由兔病毒性出血癥病毒（RHDV)引起的兔的急 性、高度接觸性傳染病，一年四季各種家兔均易感。本病特征為呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、實(shí)質(zhì) 臟器水腫、淤血及出血性變化。1984年在我國江蘇省無錫首次發(fā)現(xiàn)以來，隨后迅速蔓延至全 國多個(gè)省、市。迄今朝鮮、韓國、意大利、法國、德國、捷克、美國及新西蘭等國均有本病的流 行。本病潛伏期短，發(fā)病急、病程短、傳播快，發(fā)病率及死亡率極高，常呈爆發(fā)性流行，給養(yǎng)兔 業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為危害養(yǎng)兔業(yè)最嚴(yán)重的一種疾病。至今，對REDV感染無有效 治療藥物，因此重在預(yù)防。目前臨床上使用RHD滅活疫苗進(jìn)行預(yù)防，但存在許多缺陷：注射 后不能快速誘導(dǎo)高效價(jià)的抗體產(chǎn)生，而有些家兔在產(chǎn)生保護(hù)性抗體前就已經(jīng)感染了兔瘟病 毒；抗體的保護(hù)期短，抗體水平下降迅速，如不及時(shí)二免，抗體效價(jià)很快低于正常值；疫苗 的保存條件較嚴(yán)格，如保存不當(dāng)易造成疫苗效價(jià)降低。因此，亟需研制一種新型、高效的兔 出血癥疫苗。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了滿足開發(fā)新型佐劑的需求，本發(fā)明提供了一種獸用疫苗及其制備方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種獸用疫苗，所述疫苗由質(zhì)量比為4-11:89-96 的免疫佐劑和抗原水溶液組成。
[0008] 所述抗原水溶液由血凝效價(jià)多101og2的兔出血癥病毒病料與生理鹽水按質(zhì)量比 1:10的比例混合，充分勻漿后得到抗原水溶液。
[0009] 所述免疫佐劑由下列原料以質(zhì)量份組成：泰山松花粉多糖5-30份、蜂膠5-10份、 蘆薈多糖5-10份、覆盆子多糖8-14份、老君須多糖3-6份、打碗花多糖4-9份、親水性表面 活性劑〇. 1-10份、高分子膠束物質(zhì)〇. 1-10份和水40-90份。
[0010] 所述親水性表面活性劑為司班80和普魯尼克121的混合物；所述司班80和普魯 尼克121的質(zhì)量份數(shù)比為：司班80為1-2. 5份、普魯尼克121為1-3份。
[0011] 所述高分子膠束物質(zhì)為殼聚糖和卡波姆971P的混合物；所述殼聚糖和卡波姆 971P的質(zhì)量份數(shù)比為：殼聚糖為1-3份、卡波姆971P為2-3份。
[0012] 所述泰山松花粉多糖的提取方法為：將破壁后的泰山松花粉用索氏提取器在 48°C -50°C抽提脂肪2h后得產(chǎn)物1，產(chǎn)物1加入占產(chǎn)物1質(zhì)量0. 3%的胃蛋白酶在50°C反應(yīng) 2h除蛋白后，用80-KKTC熱水浸提7-10h，隨后降溫至4°C沉淀8-12h，然后取上清液一以 10000 r/min過濾離心10 min，在200 r/min和60°C條件下減壓濃縮，得濃縮液；取Sevage 試劑和濃縮液按質(zhì)量比為1:3混合均勻后放置3h后，取上清液二；再將上清液二與Sevage 試劑按質(zhì)量比3:1混合均勻，靜置2h后，取上清液三，然后將上清液三用無水乙醇沉淀 7-10h，將沉淀物在-15°C~-20°C冷凍干燥得到松花粉多糖。
[0013] 所述覆盆子多糖的制備方法包括以下步驟：取覆盆子洗凈干燥后將果肉粉碎制得 覆盆子干粉，加入質(zhì)量為覆盆子干粉質(zhì)量7~9倍的石油醚和醇濃度為95%的乙醇混合物 浸泡并超聲處理30~40 min，過濾后，得殘?jiān)?；用相對于殘?jiān)毁|(zhì)量10~15倍的醇濃 度90%~95%的乙醇浸泡，加熱回流1~2h后提取，過濾，得第一過濾液和殘?jiān)?；殘?jiān)?中加入相對于殘?jiān)|(zhì)量10~15倍的去離子水后，加入復(fù)合酶A于30-39°C、pH5-6. 5下 酶解5h-6h，酶解結(jié)束后滅酶得到提取液；將第一過濾液和提取液混合后在真空度0. 06~ 0. 09Mpa下減壓濃縮至50~60°C時(shí)相對密度為1. 04~1. 10的膏體，向膏體中加入相對于 膏體質(zhì)量6-8倍的醇濃度為95%的無水乙醇，沉淀8h，高速離心后真空干燥得覆盆子多糖； 所述復(fù)合酶A為酸性木聚糖酶和P -葡聚糖酶組成的復(fù)合酶，酸性木聚糖酶質(zhì)量用量為覆 盆子干粉質(zhì)量的2. 0%、P -葡聚糖酶質(zhì)量用量為覆盆子干粉質(zhì)量的4. 5% ;所述石油醚和 醇濃度95 %的乙醇體積比為1:5 ; 和/或所述蘆薈多糖的制備方法包括以下步驟：取2-3年蘆薈鮮葉洗凈，在去離子水中 浸泡20-40min，以除去表皮滲出的黃色液汁，然后切去表皮，將內(nèi)層凝膠剪碎，用勻漿機(jī)勻 漿后取上清液在4°C冷藏8-10h得到蘆薈汁；將蘆薈汁與去離子水按質(zhì)量比1:12-15比例 混合，加入復(fù)合酶B在32-36°C、pH5. 2-6. 5下酶解5-8h，酶解結(jié)束后滅酶得提取液，將提取 液在真空度0. 06~0. 09Mpa下減壓濃縮至50~60°C時(shí)相對密度為1. 04~1. 10的膏體， 向膏體中加入相對于膏體質(zhì)量5-7倍的醇濃度為95%的無水乙醇，沉淀8h，高速離心得蘆薈 多糖沉淀；再用Sevage試劑和蘆薈多糖沉淀質(zhì)量比為1:3混合均勻靜置l_2h，然后取上清 液真空干燥得蘆薈多糖；所述復(fù)合酶B為酸性木聚糖酶和P -葡聚糖酶組成的復(fù)合酶，酸性 木聚糖酶質(zhì)量用量為蘆薈汁質(zhì)量的3. 0%、0 -葡聚糖酶質(zhì)量用量為蘆薈汁質(zhì)量的2. 5%。
[0014] 和/或所述老君須多糖的制備方法包括以下步驟：取老君須洗凈干燥后，粉碎制 得老君須干粉，老君須干粉與去離子水按1:15-20混合，80-9(TC浸提8 h，減壓濃縮后離 心3次，每次離心的轉(zhuǎn)速為12000r/m，每次離心的時(shí)間為12min，每次離心的溫度為15°C，以 除盡雜質(zhì)；隨后在真空度〇. 06~0. 09Mpa下減壓濃縮至50~60°C時(shí)相對密度為1. 04~ 1. 10的膏體，向膏體中加入相對于膏體質(zhì)量5-7倍的醇濃度為95%的乙醇，沉淀8 h，高速 離心得老君須多糖沉淀；再用Sevage試劑和老君須多糖沉淀質(zhì)量比為1:3混合均勾，靜置 l_2h后取上清液真空干燥得老君須多糖。
[0015] 和/或所述打碗花多糖的制備方法包括以下步驟：取打碗花洗凈干燥后，粉碎制 得打碗花干粉，打碗花干粉與去離子水按1:18-22混合，85-95°C浸提8 h，減壓濃縮后離 心3次，離心工藝參數(shù)為11000 r/min、15 min和20°C，以除盡雜質(zhì)；隨后在真空度0.05~ 0. 07Mpa下減壓濃縮至60~70°C時(shí)相對密度為I. 1~1. 15的膏體，向膏體中加入相對于 膏體質(zhì)量8-9倍的醇濃度為95%的無水乙醇，沉淀8h，高速離心得打碗花多糖沉淀；再用 Sevage試劑和打碗花多糖沉淀質(zhì)量比為1:3混合均勻，靜置l_2h后取上清液真空干燥得打 碗花多糖。
[0016] 為了更好地實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明還提供一種獸用疫苗中使用的免疫佐劑的制備 方法，包括以下步驟：按配方量分別稱取各組分混合均勻得混合物，混合物冰水浴2-3h后， 用機(jī)械乳化法乳化，得到免疫佐劑，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0017] 所述機(jī)械乳化法采用設(shè)備為膠體磨或組織勻漿機(jī)。
[0018] 為了更好的實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明還提供一種獸用疫苗的制備方法，其特征在 于，所述制備方法包括以下步驟：向抗原液中分別加入免疫佐劑，充分混勻，然后用終濃度 0. 4%的甲醛滅活48 h，得到兔病毒性出血癥免疫疫苗，所述免疫佐劑與抗原水溶液質(zhì)量比 為 4-11:89-96。
[0019] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是： 1.本發(fā)明提供的獸用疫苗對動物無毒副反應(yīng)，有效解決了疫苗副反應(yīng)的問題，且易儲 存，易于注射，使用方便，作用效果好。
[0020] 2.本發(fā)明提供的獸用疫苗，制備工藝簡單、成本低、得到的劑型穩(wěn)定；成分簡單、 易儲存，易于注射，使用方便，作用效果好，無副反應(yīng)，在畜牧業(yè)中的開發(fā)利用潛力巨大，具 有廣闊的應(yīng)用前景。
[0021]
【附圖說明】
[0022] 圖1疫苗免疫后各組兔外周血IL-2濃度的比較 圖2疫苗免疫后各組兔外周血IL-4濃度的比較 圖3疫苗免疫后各組兔外周血IL-10濃度的比較 圖4疫苗免疫后各組兔外周血IFN-y濃度的比較
【具體實(shí)施方式】
[0023] 針對開發(fā)新型疫苗的問題，本發(fā)明提供一種獸用疫苗及其制備方法。
[0024] 松花粉多糖由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖等 單糖組成?，F(xiàn)代研究證明，松花粉多糖是保持松花粉特效的營養(yǎng)成份之一，具有非常高的生 物活性，松花粉破壁后多糖提取量顯