在水溶液中的穩(wěn)定性在濃度為lg/100ml的水性鹽溶 液在50°C下和在單獨(dú)的測(cè)試中在非常嚴(yán)格的條件（100°C，其中在一小時(shí)后測(cè)定到分解）下 溫育后進(jìn)行測(cè)定。
[0067] 表2 :在50°C /時(shí)間（小時(shí)）下水中的十五肽含量涕減:
[0068]
[0071] 化合物特別是肽在胃液中的穩(wěn)定性是重要的參數(shù)，肽在胃蛋白酶的存在下以及在 酸性介質(zhì)中非常迅速地分解。在胃液中更好的穩(wěn)定性意味著更長(zhǎng)的時(shí)間，在其中化合物可 用于吸收和發(fā)揮其治療活性。
[0072] 人工胃液顯示了正常人胃液中的條件，并包含：1000 ml水中0. 08mol鹽酸， 0? 03mol氯化鈉和I.Og胃蛋白酶。
[0073] 所研究的10mg/5ml濃度的肽鹽在具有pH值2. 0、3. 0和4. 0的人工胃液中在37°C 下溫育。
[0074] 表4 :在DH = 2. 0下胄液中的十五肽含量涕減（相對(duì)％ )

[0081] 十五肽BPC-157在測(cè)試樣品中的含量在下列系統(tǒng)中通過(guò)HPLC方法測(cè)定：
[0082]柱：Reprosil Orpegen C18, 100, 5 y m，250 X 4. 6mm，
[0083] 流動(dòng)相A :0.1 %三氟乙酸/5%乙腈/水
[0084] 流動(dòng)相B :0. 11 %三氟乙酸/40%乙腈/水
[0085] 梯度：在25分鐘內(nèi)從100% A至30% A
[0086]溫度：20 cC
[0087]流速：1. 5ml/分鐘
[0088]檢測(cè)：UV，2IOnm
[0089] 穩(wěn)定性測(cè)定的結(jié)果表明，具有堿性氨基酸的bepecin鹽比其它的迄今已知的存在 問(wèn)題的十五肽鹽實(shí)質(zhì)上更加穩(wěn)定，這是令人驚訝的巨大的優(yōu)勢(shì)。在任何情況下，這些新型的 鹽比根據(jù)專利EP 0983300和US No. 6, 288, 028所述的具有不同胺、堿金屬和堿土金屬的 bepecin鹽（其易于形成極性降解產(chǎn)物（多至10%，結(jié)構(gòu)尚未確定））更好。更好的穩(wěn)定性 的結(jié)果還是更好的生物活性，因?yàn)橥暾衔锎嬖谟谏矬w中的時(shí)期更長(zhǎng)并且可用于更有 效的吸收。
[0090] 在光下的穩(wěn)定性
[0091] 這種類(lèi)型的化合物對(duì)于紫外光非常易感。用波長(zhǎng)253. 7nm的紫外光輻照20°C下 的Arg-BPC(lg/100ml水）水性溶液，隨后在230至350nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)在70分鐘的時(shí)期 內(nèi)每10分鐘測(cè)量吸光度。結(jié)果示于圖1中，并確認(rèn)該化合物是穩(wěn)定的。
[0092] 作為本發(fā)明的目的的新型的bepecin鹽可用作治療活性物質(zhì)，其與惰性的藥學(xué)可 接受的載體一起被轉(zhuǎn)化為合適的形式例如片劑和膠囊劑，用于治療疾病和病狀、生物體損 傷、創(chuàng)傷、骨折和燒傷以及病毒感染，如通過(guò)之前的藥理學(xué)研究所確定的。
[0093] 本發(fā)明的目的還是含有與不同添加劑混合的bepecin鹽的氨基酸鹽的口服藥物 制劑。所使用的藥學(xué)可接受的添加劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員一般熟知的物質(zhì)。惰性物質(zhì)或藥物 添加劑選自下列組：
[0094]-填充劑例如：無(wú)水乳糖，微晶纖維素，淀粉，磷酸鈣，碳酸鈣，麥芽糖糊精，D-甘露 糖醇，海藻糖等；
[0095]-粘合劑例如：微晶纖維素，羥烷基纖維素，聚維酮，纖維素酯，淀粉或其混合物；
[0096]-崩解劑例如：淀粉，交聯(lián)羧甲纖維素鈉（crosslinked sodium croscarmelose)， 交聚維酮，微晶纖維素，羧甲基纖維素鈉等，主要為1-10%的量；
[0097] _穩(wěn)定劑例如：堿金屬和堿土金屬碳酸氫鹽或所選擇的糖，優(yōu)選碳酸氫鈉和D-甘 露糖醇；
[0098]-在壓片中使用的潤(rùn)滑劑和助流劑：滑石，硬脂酸鎂，硬脂酸，硬脂酸鉀和膠體二 氧化硅。這些物質(zhì)通常在最后階段加入到其它成分中。
[0099] bepecin鹽在具有不同酸度的溶液中的穩(wěn)定性的比較顯示，該化合物在微酸性、中 性或甚至微堿性介質(zhì)（優(yōu)選在6. 5至8. 5的pH范圍中）中是最穩(wěn)定的。合理地，在組成藥 物制劑中應(yīng)當(dāng)考慮此。在用于壓片和封裝的顆粒的制備中，適當(dāng)?shù)靥砑游A性物質(zhì)例如堿 金屬和堿土金屬碳酸氫鹽和碳酸鹽、堿性碳酸鹽和氧化物，諸如碳酸氫鈉、碳酸氫鈣和氧化 鎂，從而提高穩(wěn)定性。所選擇的糖的添加防止美拉德反應(yīng)。藥物制劑通過(guò)已知的方法制備， 例如直接混合，干法造粒，濕法造粒，或通過(guò)在暖風(fēng)逆流的同時(shí)干燥下將bepecin鹽溶液噴 霧到惰性制藥物質(zhì)上來(lái)制備。如果需要的話，向如此獲得的顆粒添加其它成分，以常規(guī)方式 均化和壓片或封裝。在最后的階段，片劑、膠囊或錠劑可用對(duì)胃液活性有抗性的保護(hù)膜包 衣，以使bepecin釋放不比在腸內(nèi)更早。
[0100] 本發(fā)明的新型鹽中的氨基酸成分是這種形式中活性物質(zhì)的更大疏水性的原因。因 此，期望更好地轉(zhuǎn)移通過(guò)生物膜是現(xiàn)實(shí)的，這也提供用于透皮制劑例如乳膏、軟膏或貼劑的 制造。
[0101] 透皮系統(tǒng)由活性物質(zhì)不能透過(guò)的支持層、用作活性物質(zhì)儲(chǔ)庫(kù)的壓敏聚合物層、在 幾個(gè)位置穿孔以允許活性物質(zhì)穿過(guò)其中的保護(hù)箱和外層保護(hù)箱組成。
[0102] B印ecin鹽可以以溶液、灌腸劑、注射劑或干注射劑的形式使用。在這種情況下，具 有介于6和8之間，優(yōu)選介于7. 0和7. 5之間的最適pH值的緩沖劑的水性溶液用作溶劑。 該溶液可通過(guò)精細(xì)過(guò)濾經(jīng)過(guò)具有0. 22 ym孔的過(guò)濾器或通過(guò)非常短的加熱至IOOtC來(lái)進(jìn)行 滅菌。干注射劑以含有bepecin鹽、緩沖劑和防腐劑的無(wú)菌溶液在安瓿中凍結(jié)并凍干的方 式制備。
[0103] 旨在用于眼或鼻滴劑的溶液通過(guò)使用具有7. 0至7. 5的pH值的等滲和等氫離子 溶液制備，其除了活性物質(zhì)bepecin以外還含有緩沖劑和防腐劑并在無(wú)菌條件下過(guò)濾。 [0104]用于直腸和陰道使用的栓劑通過(guò)采用明膠、可可脂、具有低熔點(diǎn)的天然或半合成 脂肪、石蠟、甘油、具有1000至6000的基礎(chǔ)分子量的聚乙二醇，向其中混入bepecin的水性 溶液來(lái)制備。此外，可添加乳化劑、抗氧化劑和防腐劑。
[0105] Bepecin鹽還可以以乳膏、軟膏或凝膠的形式使用。在這種情況下，使用基于天 然的、植物或動(dòng)物脂肪和天然油的親脂性、親水性或兩親性脂肪基質(zhì)，向其中也可添加防腐 劑、著色劑、乳化劑、水或緩沖溶液以及抗氧化劑。
[0106] B印ecin是在極低劑量下起作用的化合物。用于口服使用的治療劑量的范圍將是 KT 5至KT 2mg/kg體重，其取決于疾病的類(lèi)型和嚴(yán)重程度。片劑、錠劑或膠囊劑中常用的劑 量范圍將是從0.1到至多5mg。局部使用的濃度更高，范圍為0.001 %至0.5%。最佳劑量 的確定根據(jù)評(píng)估和經(jīng)驗(yàn)而定。非常重要的是，bepecin不顯示任何副作用或毒性。基于上述 以及其對(duì)生物體眾多的有利效應(yīng)，還可能將其以非常低的劑量（從每日I yg到至多0.1 mg) 用于食品補(bǔ)充劑的形式。在為此目的制備的制劑中，其還可與維生素、礦物質(zhì)和其它有利作 用的物質(zhì)相結(jié)合。
[0107] 根據(jù)本發(fā)明，還可添加改善b印ecin的主要活性或協(xié)同地作用的其它單一活性物 質(zhì)。這些是來(lái)自下列組中的物質(zhì)：
[0108] _具有抗菌活性的物質(zhì)，例如慶大霉素，阿奇霉素，氨芐青霉素，頭孢菌素和多西環(huán) 素，特別是在用于局部使用的制劑中，其中期望同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗病毒和抗菌活性。這樣的例子是 蜱叮咬，其中意圖是雙重的：同時(shí)防止疏螺旋體（borellia)和蜱傳腦炎；
[0109]-具有抗氧化劑活性的物質(zhì)，例如干燥的綠茶提取物，輔酶Q1。，依地吡喃，姜黃素，abigenol，碧蘿]E等。
[0110]與輔酶Qw或泛醌的結(jié)合是特別有利的。輔酶Q11:是非常有效的抗氧化劑和自由基 清除劑，并且可另外地用于與血流量減少、高血壓相關(guān)的心臟疾病和心功能不全的體征。最 近已證實(shí)一個(gè)重要的抗氧化劑還是具有強(qiáng)大抗癌活性的姜黃素。
[0111] 我們的研究已證實(shí)新型bepecin鹽在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如多發(fā)性硬化中非常 有利的活性。此炎性疾病導(dǎo)致對(duì)腦和脊髓中軸突周?chē)乃枨实膿p害。神經(jīng)細(xì)胞通常通過(guò)神 經(jīng)纖維-軸突發(fā)送電子信號(hào)進(jìn)行通信，其中髓鞘是絕緣體。在髓鞘損壞的情況下，電信號(hào)傳 導(dǎo)中斷或極度擾亂。在多發(fā)性硬化中，機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊并損壞髓鞘。針對(duì)多發(fā)性硬化沒(méi) 有已知有效的治療方法。現(xiàn)有的治療旨在改善攻擊后的功能，預(yù)防新的攻擊，但通常具有有 害效應(yīng)或難以耐受。
[0112] Bepecin具有抗炎性、修復(fù)性、保護(hù)性和免疫調(diào)節(jié)活性。
[0113] 藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，預(yù)期bepecin對(duì)多發(fā)性硬化具有良好的治療效應(yīng)。具有 bepencin-L-精氨酸鹽的制劑的使用在由感染萊姆疏螺旋體?。↙. Reik et all. ,Neurolo gy,巡，1989, 790 - 795)或梅毒（D. Grey, The Lancet, July 12, 1986, 75 - 77)引起繼發(fā)性 損傷和障礙的輔助治療中可以是有用的。在所有這些情況中，髓鞘受損且腦中的病變可用 MRL可見(jiàn)。
[0114] 多發(fā)性硬化將由含有穩(wěn)定形式的Img至5mg劑量的bepecin鹽的口服制劑來(lái)治 療。bepecin制劑的使用不與有害的或令人不快的副作用相關(guān)，它們對(duì)于長(zhǎng)期施用也是安全 的。
[0115] 在對(duì)動(dòng)物的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，據(jù)信合適藥物制劑的形式的具有堿性氨基酸的 bepecin鹽的使用還將在其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如神經(jīng)病、重癥肌無(wú)力等中是有益的。
[0116] Bepecin還對(duì)于側(cè)支血管在股動(dòng)脈嚴(yán)重?fù)p傷后的重組具有非常有益的效應(yīng)。
[0117] 本發(fā)明進(jìn)一步顯示但不局限于下列意欲澄清工藝的實(shí)施例中。實(shí)施例18至44描 述為測(cè)定b印ecin的藥理學(xué)活性而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。它們已通過(guò)使用實(shí)踐中和引用的文獻(xiàn)來(lái)源 中廣泛使用的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)實(shí)施。在所有的實(shí)驗(yàn)中Bepecin以具有L-精氨酸的 鹽的形式使用。
[0118] 附圖簡(jiǎn)述
[0119] 圖1:顯示當(dāng)通過(guò)紫外光福照時(shí)，bepecin溶液的穩(wěn)定性；樣品1至7的吸光度各 自測(cè)量10分鐘。
[0120] 圖2 :顯示b印ecin對(duì)黑色素瘤B-16細(xì)胞的活性。
[0121] 圖3 :顯示b印ecin對(duì)蜱傳腦炎病毒（TBE)的效應(yīng)：
[0122] A :IO2TBE 病毒（i. c. V.)和無(wú) bepecin 的 0? 9% NaCl 鹽水（i. p.)的同時(shí)施用。
[0123] B :102 TBE 病毒（i. c.V.)和 10 y g/kg bepecin(i. p.)的同時(shí)施用。感染癥狀發(fā) 生在相當(dāng)晚的階段。
[0124]C :10 y g/kg bepecin(i. p.)在用 IO2 TBE 病毒（i. c.V.)感染前 4 小時(shí)的施用。 沒(méi)有疾病的臨床體征。30天之后，將動(dòng)物無(wú)痛致死，并將一部分腦勻漿物轉(zhuǎn)移至新的動(dòng)物； 見(jiàn)：D。
[0125] D:腦勻漿物的和用IO2TBE病毒（i. c. V.)的新感染的同時(shí)施用。即使在50天后 也沒(méi)有疾病的體征。
[0126] 圖4 :bepecin鹽的1H-NMR光譜，在D2O中記錄：
[0127] A :bepecin L-賴氨酸鹽（1:3)的光譜，
[0128] B :bepecin L-精氨酸鹽（1:2)的光譜，
[0129] C :b印ecin L-鳥(niǎo)氨酸鹽（1:2)的光譜。
[0130] 圖5:顯示側(cè)支血管：
[0131] A :只經(jīng)歷局部鹽水浴1分鐘的對(duì)照組-無(wú)側(cè)支血管可見(jiàn)；
[0132] B :經(jīng)歷b印ecin浴1分鐘的測(cè)試組-可見(jiàn)具有安全的相互連接的大量側(cè)支血管。 實(shí)施例
[0133] 實(shí)施例1 :b印ecin D-精氨酸鹽（1:2)的制備
[0134] Bepecin三氟乙酸鹽（500mg，0. 34mmol)溶解在25ml水中。伴隨溫和攪拌，逐漸加 入D-精氨酸（212mg，I. 22mmol)，并再攪拌15分鐘。該溶液的pH值隨后用稀乙酸（50% ) 調(diào)節(jié)至7. 40±0. 05。將溶液過(guò)濾澄清并冷凍干燥。將凍干物溶解在少量水中，并施加在經(jīng) 預(yù)先洗滌和用純水平衡的HPLC柱（ID = 2.2cm, h = 25cm,吸附劑Reprosil C18, IOym)的 起始處。用具有增加濃度的異丙醇的水進(jìn)行洗脫：從〇至5%的異丙醇，30分鐘。棄去含有 鹽和雜質(zhì)的第一級(jí)分。將收集的主要級(jí)分冷凍干燥。獲得含有2mol D-精氨酸/Imol十五 肽的550mg干燥鹽。
[0135] 氨基酸分析對(duì)應(yīng)于如下組成：
[0136] 2-Ala, 1-Val, 3-Gly, 4-Pro, 1-Leu, 2-Asp, 1-Glu, 1-Lys, 2~Arg〇
[0137] MS (TOF MS ES+) =M1= 1419. 8(十五肽+H+)
[0138] M2= 175. I (D-精氨酸 +H +)
[0139] FTIR S? (cm-1) :3275, 3057, 2958, 2872, 1628, 1533, 1448, 1394, 1315, 1244, 1204, I 161, 1096, 1044, 919, 875〇
[0140]比旋度（c = lg/lOOml) [a ]D28= - 154°。HPLC 純度：99.48%。
[0141] 實(shí)施例2 :b印ecin L-精氨酸鹽（1:1)的制備
[0142] 具有b印ecin乙酸鹽和L-精氨酸的溶液按實(shí)施例1所述制備。該溶液的pH值用 稀乙酸（50% )調(diào)節(jié)至4. 60±0. 05,類(lèi)似于實(shí)施例1處理得到的溶液。獲得含有Imol L-精 氨酸/lmol bepecin的232mg無(wú)定形粉末。
[0143] 氨基酸分析對(duì)應(yīng)于如下組成：
[0144] 2-Ala, 1-Val, 3-Gly, 4-Pro, 1-Leu, 2-Asp, 1-Glu, 1-Lys,l~Arg〇
[0145] MS(TOFMSES+) =M1= 1419. 8(十五肽 +H)
[0146] M2= 175. I (L-精氨酸 +H)
[0147] FTIRW(cm-:) : 3265, 3060, 2960, 2875, 1629 (CONH), 1534, 1448, 1394, 1312, 1243, 1202,1160, 1043, 919, 873