所示；適配體通過交聯(lián)劑與納米脂質(zhì)體連接；所述 交聯(lián)劑為 DSPE-PEG2QQQ-Mal ;
[0093] 核心為含有IP-10基因的載體GV143 IP-10，GV143 IP-10表達(dá)SEQ ID No. 2所示 的IP-10, GV143 IP-10中IP-10基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No. 3,編碼SEQ ID No. 2 所示的 IP-10。
[0094] l、ENG-Apt/IP-10-LP 的制備
[0095] SI、納米脂質(zhì)體（LP)的制備
[0096] 將棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿（l-palmitoyl-2-〇leoyl-sn-glycer〇-3-phosphoc holine，P0PC) 7. 87mg、膽固醇（cholesterol) 3. 2mg、聚乙二醇 2000-二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺（DSPE-PEG2。。。) 2. 8mg、雙十二烷基二甲基溴化銨（DDAB) 0. 38mg、和a -生育酚 0? 017mg(P0PC、膽固醇、DSPE-PEG2_、DDAB 和 DSPE-PEG2。。。的摩爾比為 51. 8 :40 :5 :3 :0? 2) 加入到5ml的圓底燒瓶中，將燒瓶接到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以轉(zhuǎn)速為200rpm/min旋 轉(zhuǎn)并打開真空栗抽真空。待看到圓底燒瓶表面產(chǎn)生一層水汽后，將瓶身降至水浴鍋中于 35°C下水浴，旋轉(zhuǎn)10min后即可關(guān)閉真空并停止旋轉(zhuǎn)，得到盛有反應(yīng)后試劑的圓底燒瓶；將 盛有反應(yīng)后試劑的圓底燒瓶放至真空干燥箱中干燥2h去除有機(jī)溶劑后，加入lml的三羥甲 基氨基甲烷鹽酸緩沖液（pH6. 5,50mmol/l)，得到混合液；將混合液水?。?5°C _45°C )超聲 5min，得到白色懸液；將白色懸液加入脂質(zhì)體擠出器的玻璃注射器中，依次過200nm聚碳酸 酯膜20次、100nm聚碳酸酯膜20次和50nm聚碳酸酯膜21次，得到納米脂質(zhì)體。
[0097] S2、包裹IP-10基因的PEG化納米脂質(zhì)體（LP-IP-10)的制備
[0098] 按照1滴/秒的速度向步驟S1得到的200 y 1脂質(zhì)體中滴加濃度為2 y g/ y 1的 GV143 IP-10水溶液（GV143 IP-10水溶液為將質(zhì)粒GV143 IP-10溶于去離子水得到的溶 液）20 y 1，得到脂質(zhì)體-質(zhì)?；旌弦?；向脂質(zhì)體-質(zhì)粒混合液中逐滴滴加70 % (體積百分比 濃度）的乙醇水溶液，邊滴加邊旋轉(zhuǎn)彈勻避免局部乙醇濃度過高，得到脂質(zhì)體-質(zhì)粒-乙醇 混合液，脂質(zhì)體-質(zhì)粒-乙醇混合液中乙醇的體積百分比濃度為35%;向脂質(zhì)體-質(zhì)粒-乙 醇混合液中逐滴滴加200mM的CaCl 2水溶液，邊滴加邊旋轉(zhuǎn)彈勻避免局部CaCl 2濃度過高， 得到脂質(zhì)體-質(zhì)粒-乙醇-CaCl 2混合液，脂質(zhì)體-質(zhì)粒-乙醇-CaCl 2混合液中CaCl 2的濃 度為4mM ;將脂質(zhì)體-質(zhì)粒-乙醇-CaCV混合液水浴（65°C )超聲5min，得到混合液F ;將混 合液F轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)，進(jìn)行5個循環(huán)的反復(fù)凍融，得到包裹IP-10基因的PEG化納米脂質(zhì) 體（LP-IP-10)，每個循環(huán)的凍融環(huán)境及時間分別為液氮10min，37°C水浴2min，室溫4min。
[0099] S3、DSPE-PEG2_-Aptamer 的制備
[0100] 將16. 8 y 1 10mg/ml的磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺（DSPE-PEG2。。。-Mai) 儲存液于離心管中，在室溫下自然吹干形成脂膜，用20yl的Tris-HCl緩沖液（pH6. 5， 10mmol/l)重懸脂膜，在65°C下水浴5-10min，形成即膠束液；向膠束液中加入疏基修飾的 ENG-Aptamer溶液15 y 1混合均勻后封口 4°C孵育過夜，得到混合液I ;向混合液中加入與 DSPE-PEG2。。。-Mai等摩爾的0 -半胱胺，室溫下孵育30min，封閉未反應(yīng)的馬來酰亞胺，得到 DSPE-PEG2_-ENG-Aptamer。
[0101] S4、負(fù)載IP-10基因的ENG-Aptamer修飾的納米脂質(zhì)體（ENG-Apt/IP-10-LP)的制 備
[0102] 向步驟S2得到的包裹IP-10基因的PEG化納米脂質(zhì)體中加入步驟S3得到的 DSPE-PEG 2。。。-ENG-Aptamer，得到混合液R，混合液R中包裹IP-10基因的PEG化納米脂質(zhì)體 與DSPE-PEG 2。。。-ENG-Aptamer的比例關(guān)系為400mol :lmol ;將混合液R在55°C水浴中反應(yīng) 30min，得到反應(yīng)液；將反應(yīng)液進(jìn)行透析，得到負(fù)載IP-10基因的ENG-Aptamer修飾的納米脂 質(zhì)體（ENG-Apt/IP-10-LP)。透析時間為4小時，2小時更換一次透析液，透析袋的截留分子 量為10000，透析液為由去離子水、Tri s-HCl、氯化鈉組成的液體，透析液中氯化鈉的濃度為 140mmol/L，Tris-HCl 的濃度為 25mmol/L，透析液的 pH 為 7. 0)。
[0103] 按照上述方法，將步驟S2得到的包裹IP-10基因的PEG化納米脂質(zhì)體替換為步驟 S1得到的納米脂質(zhì)體，其他步驟均不變，得到ENG-Aptamer修飾的納米脂質(zhì)體（ENG-Apt/ LP) 〇
[0104]透射電鏡下觀察上述納米脂質(zhì)體（LP)、LP-IP-10、ENG-Apt/LP和ENG-Apt/ IP-10-LP，結(jié)果如圖1所示。其中，A為納米脂質(zhì)體；B為ENG-Apt/LP ;C為LP-IP-10 ;D 為 ENG-Apt/IP-10-LP。納米脂質(zhì)體（LP)、ENG-Apt/LP、LP-IP-10 和 ENG-Apt/IP-10-LP 的 粒徑如圖2所示。其中，A為納米脂質(zhì)體；B為ENG-Apt/LP ;C為LP-IP-10 ;D為ENG-Apt/ IP-10-LP。結(jié)果顯示，每種納米粒子的粒徑分布均呈現(xiàn)正態(tài)分布，納米脂質(zhì)體的粒徑在85nm 左右；ENG-Apt/LP 的粒徑在 89nm 左右；LP-IP-10 的粒徑在 103nm 左右，ENG-Apt/IP-10-LP 的粒徑在113nm左右。
[0105] 將GV143IP-10及上述LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖 3)，結(jié)果顯示GV143IP-10 (圖3中泳道1)有條帶，LP-IP-10 (圖3中泳道2)和ENG-Apt/ IP-10-LP(圖3中泳道3)均在加樣孔由明亮條帶；而將LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP的 脂質(zhì)體破裂后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖3)，結(jié)果顯示，LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP的脂 質(zhì)體破裂后（圖3中泳道4和5)，表明，LP-IP-10和ENG-Apt/IP-10-LP均成功裝載了質(zhì)粒 GV143IP-10。泳道6為LP+10% Trition X100,該泳道無條帶有效排除處理因素的干擾，泳 道7為pDNA+10%Trition X100,該泳道無條帶說明Trition X-100對質(zhì)粒沒有明顯的干 擾。
[0106] 2、ENG-Apt/IP-10-LP 的穩(wěn)定性檢測
[0107] 將ENG-Apt/IP-10-LP分別在C57小鼠血清、含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和雙 抗的DMEM培養(yǎng)基中于37°C條件下分別孵育10min、0. 5h、1. 5h、4h、6h和8h后，進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳檢測ENG-Apt/IP-10-LP的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，ENG-Apt/IP-10-LP在雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育時，幾乎均無質(zhì)粒釋放，ENG-Apt/IP-10-LP在小鼠血清及含20%胎牛血 清的DMEM培養(yǎng)基中GV142IP-10都保持低釋放，表明ENG-Apt/IP-10-LP表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定 性。
[0108] 實施例2、負(fù)載IP-10基因的ENG-Aptamer修飾的納米脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的靶向作 用
[0109] 將實施例1的ENG-Apt/IP-10-LP分別用綠色熒光FITC (異硫氰酸熒光素）和紅 色熒光Dil標(biāo)記，分別得到FITC標(biāo)記的ENG-Apt/IP-10-LP與Dil標(biāo)記標(biāo)記的ENG-Apt/ IP-10-LP ;將 FITC 標(biāo)記的 ENG-Apt/IP-10-LP 與 Dil 標(biāo)記標(biāo)記的 ENG-Apt/IP-10-LP 分別與 293T-mE在37°C下孵育45min，在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4中A所示。另外將293T-mE替 換為293T細(xì)胞其他步驟均不變作為對照。
[0110] 將非熒光標(biāo)記的ENG-Aptamer預(yù)先與293T-mE孵育30min，再分別加入FITC標(biāo)記 的 ENG-Apt/IP-10-LP 與 Dil 標(biāo)記標(biāo)記的 ENG-Apt/IP-10-LP，在 37°C下孵育 45min，在顯微 鏡下觀察，結(jié)果如圖4中A所示。另外將293T-mE替換為293T細(xì)胞其他步驟均不變作為對 照。
[0111] 另外取 Dil 標(biāo)記的 ENG-Apt/IP-10-LP 與 LP-IP-10 分別與 293T-mE 細(xì)胞在 37°C下 孵育45min，在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4中B所示。
[0112] 其中，圖4中A為熒光顯微鏡下觀察ENG-Apt/IP-10-LP與293T及293T-mE的 結(jié)合及通過非熒光標(biāo)記的ENG-Aptamer封閉293T-mE細(xì)胞表面受體后，細(xì)胞與ENG-Apt/ IP-10-LP結(jié)合的熒光圖片，結(jié)果表明，ENG-Apt/IP-10-LP可以與293T-mE結(jié)合，但不可以與 293T結(jié)合，當(dāng)用ENG-Aptamer封閉293T-mE細(xì)胞表面受體后，ENG-Apt/IP-10-LP不可以與