纖維化和癌癥的治療方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物1-[4-甲基硫苯基]_3_[3, 5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯 基]丙-2-烯-1-酮在治療纖維化疾病和癌癥中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 酪氨酸激酶是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的重要介導(dǎo)物，對(duì)外部和內(nèi)部刺激物作出響應(yīng)而決定 了在多種多樣的生物過(guò)程如生長(zhǎng)、分化、代謝和凋亡中的關(guān)鍵作用。最近的進(jìn)展暗示了酪氨 酸激酶在纖維化或癌癥的病理生理學(xué)中的作用。
[0003] 對(duì)于纖維化來(lái)說(shuō)，不同的酪氨酸激酶已被鑒定為疾病進(jìn)展的決定因素和抗纖維化 療法的潛在靶點(diǎn)。這包括受體酪氨酸激酶（例如TOGF受體、VEGF受體、EGF受體和JAK激 酶）以及非受體酪氨酸激酶（例如c-Abl、c_Kit和Src激酶）兩者[1]。在所有纖維化疾 病中，成纖維細(xì)胞（包括星狀細(xì)胞）增殖并被活化成肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞是經(jīng)歷過(guò) 度增殖的重要的產(chǎn)膠原蛋白的細(xì)胞類型[2]。TOGF是間質(zhì)起源的細(xì)胞的主要有絲分裂原。 已將TOGF的過(guò)高活性與數(shù)種人類障礙（包括器官纖維化和腫瘤發(fā)生）相關(guān)聯(lián)[3]。具體來(lái) 說(shuō)，已在肺纖維化、肝纖維化[2]、硬皮病[4-6]、腎纖維增殖性疾病[7, 8]、骨髓增殖性疾病 例如特發(fā)性骨髓纖維化[9, 10]、白血病中，尤其是在表現(xiàn)出骨髓纖維化的急性成巨核細(xì)胞 性白血病[11]和慢性髓性白血病[12-14]的發(fā)展期間在骨髓的白血病細(xì)胞中，報(bào)道了升高 的H)GF水平或活性。
[0004] 用于治療纖維化的最有希望的藥物可能是roGF受體酪氨酸激酶抑制劑。已顯示， roGFR酪氨酸激酶抑制劑的給藥在金屬誘導(dǎo)的肺損傷大鼠模型中減少肺纖維化[15]，并 且在大鼠中減輕慢性移植腎病[16]。已顯示，在患有慢性髓性白血病的患者中，非選擇性 TOGFR抑制劑伊馬替尼（Gleevec)引起骨髓纖維化的消退[17]。合在一起，這些動(dòng)物和初 步臨床研究表明，PDGF受體酪氨酸激酶的抑制能夠?yàn)楦鞣N不同組織中的纖維化疾病提供可 行的治療策略。
[0005] 除了阻斷TOGFR通路的活性的藥劑之外，在各種纖維化疾?。ɡ缣匕l(fā)性肺纖維 化、腎纖維化、肝纖維化和皮膚纖維化）的臨床前模型中還測(cè)試了阻斷其他酪氨酸激酶的 異常活性的單克隆抗體和小分子抑制劑兩者。這些研究的結(jié)果是有希望的，并促使了在纖 維化疾病中使用不同化合物的臨床試驗(yàn)。到目前為止，已報(bào)道了來(lái)自于在特發(fā)性肺纖維化 中使用intedanib以及在特發(fā)性肺纖維化和系統(tǒng)性硬化癥中使用伊馬替尼的研究的結(jié)果。 盡管這些研究都沒(méi)有報(bào)道陽(yáng)性的主要結(jié)果，但在抗纖維化效能方面有希望的趨勢(shì)喚起了我 們對(duì)一類新的有效的抗纖維化靶向療法的希望[1]。
[0006] 對(duì)于癌癥而言，生長(zhǎng)因子的過(guò)表達(dá)和隨后特定的受體酪氨酸激酶如roGFRP、 VEGFR的活化可以造成Raf/MEK/ERK有絲分裂原活化蛋白（MAP)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過(guò)度 激活[18，19]。已知Raf/MEK/ERK有絲分裂原活化蛋白（MAP)激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活直 接提高細(xì)胞增殖和存活，并且可以通過(guò)增加VEGF和TOGF的生產(chǎn)間接地刺激血管生成[18]。 這些過(guò)程是腫瘤生長(zhǎng)所需要的，因此Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子組分是用于治療癌 癥、尤其是肝細(xì)胞癌（HCC)的潛在治療靶點(diǎn)[20]。
[0007] 抗癌藥物索拉非尼抑制在血管生成中重要的上游受體酪氨酸激酶，包括VEGFR-2、 VEGFR-3JDGFR0和kit以及Raf絲氨酸/蘇氨酸激酶同工型（例如Raf-1和B-Raf)。因 此，索拉非尼可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡并抑制血管生成。還已顯示，索拉非尼在數(shù)種腫瘤細(xì)胞 系中通過(guò)尚不明確的機(jī)制誘導(dǎo)凋亡[20, 21]。索拉非尼是用于患有晚期HCC并且不適合通 過(guò)手術(shù)切除或肝移植治療的患者的第一種FDA批準(zhǔn)的系統(tǒng)療法。
[0008] 這些合在一起顯示了鑒定作用于酪氨酸激酶的新治療劑對(duì)纖維化疾病或癌癥治 療的重要性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了 1-[4-甲基硫苯基]-3-[3, 5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基] 丙-2-烯-1-酮在制備用于治療纖維化疾病和癌癥的藥物組合物中的新用途。1-[4_甲基 硫苯基]-3-[3, 5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮通過(guò)在成纖維細(xì)胞 中抑制受體和非受體酪氨酸激酶和/或抑制它們的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而具有抗纖維化 和抗癌性質(zhì)。
[0010] 圖表說(shuō)明
[0011] 在圖、表和文本中使用的縮寫(xiě)：
[0012] -Collal=I型膠原蛋白，a1
[0013] -Col4al= 4 型膠原蛋白，a1
[0014] _Cpm=每分鐘的計(jì)數(shù)
[0015] -Ctrl=對(duì)照或介質(zhì)
[0016] -EGFR=表皮生長(zhǎng)因子受體
[0017] -ERK=細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的激酶
[0018] _FBS=胎牛血清
[0019] _FCS=胎小牛血清
[0020] -FDA=食品和藥品監(jiān)督管理局
[0021] -FGFR=成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體
[0022] -GIST=胃腸道間質(zhì)瘤
[0023] -HCC=肝細(xì)胞癌
[0024] -HGFR=肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體
[0025] -hHSC=人類原代肝星狀細(xì)胞
[0026] -JAK=Janus激酶
[0027] -MAP=有絲分裂原活化蛋白
[0028] -MEK=有絲分裂原活化蛋白激酶激酶
[0029] -PDGFR=血小板衍生生長(zhǎng)因子受體
[0030] _RCC=腎細(xì)胞癌
[0031] -RT-PCR=反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)
[0032] -TGF0R=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子0受體
[0033] -VEGFR=血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體
[0034] 圖1.式（I)的化合物干擾由PDGF-BB誘導(dǎo)的hHSC細(xì)朐增葙
[0035] 在體外用作為間質(zhì)細(xì)胞的主要有絲分裂原的roGF-BB(10ng/mL)刺激人類原代肝 星狀細(xì)胞（hHSC)的增殖。使用強(qiáng)效TOGFR抑制劑Crenolanib作為陽(yáng)性對(duì)照。向細(xì)胞培養(yǎng) 物加入Crenolanib和式（I)的化合物，1小時(shí)后，用無(wú)血清培養(yǎng)基中的TOGF-BB進(jìn)行刺激。 在溫育24小時(shí)后通過(guò)測(cè)量溴脫氧尿苷（BrdU)的摻入來(lái)評(píng)估細(xì)胞增殖。
[0036]實(shí)驗(yàn)結(jié)果被表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)，并被繪制成條形圖。利用Sigma Plot 11. 0軟件，使用單因素AN0VA，然后使用Bonferroni事后檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0037] [* :p〈0. 05 ;** :p〈0. 01 ;*** :p〈0. 001 (與 PDGF-BB lOng/mL 組比較）]
[0038] 圖2.式（I)的化合物干擾由血清誘導(dǎo)的hHSC細(xì)朐增葙
[0039] 在體外用胎牛血清FBS (0. 5 % )刺激人類原代肝星狀細(xì)胞（hHSC)的增殖。使用強(qiáng) 效TOGFR抑制劑Crenolanib作為陽(yáng)性對(duì)照。向細(xì)胞培養(yǎng)物加入Crenolanib和式（I)的化 合物，1小時(shí)后，用FBS進(jìn)行刺激。在溫育48小時(shí)后通過(guò)測(cè)量溴脫氧尿苷（BrdU)的摻入來(lái) 評(píng)估細(xì)胞增殖。
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果被表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)，并被繪制成條形圖。利用Sigma Plot 11. 0軟件，使用單因素AN0VA，然后使用Bonferroni事后檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0041] [* :p〈0. 05 ;** :p〈0. 01 ;*** :p〈0. 001(與 FBS 0? 5%組比較）]
[0042] 圖3.式（I)的化合物干擾PDGF-BB誘導(dǎo)的PDGFR 3磷酸化
[0043] 在hHSC中，在無(wú)血清條件下使用TOGF-BB誘導(dǎo)TOGFR 的磷酸化。首先將HSC用 Crenolanib (PDGFR抑制劑）或式（I)的化合物處理60分鐘，然后與roGF-BB(30ng/mL)溫 育10分鐘。然后，在固定在培養(yǎng)孔中之后，使用人類Phospho-PDGFRP (Y751)基于細(xì)胞的 ELISA試劑盒（Human Phospho-PDGFRP (Y751)Cell_Based ELISA kit) (R&D Systems)測(cè)定 roGFRP在第751位酪氨酸上的磷酸化程度。
[0044]實(shí)驗(yàn)結(jié)果被表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)，并被繪制成條形圖。利用Sigma Plot 11. 0軟件，使用單因素AN0VA，然后使用Bonferroni事后檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0045] [* :p〈0. 05 ;** :p〈0. 01 ;*** :p〈0. 001 (與 PDGF-BB 30ng/mL 組比較）]
[0046] 圖4.在炎件腸病樽銦中用式（I)的化合物處理陽(yáng)lh慢件纖維化的誘導(dǎo)在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中，通討給藥式（I)的化合物，部分陽(yáng)ih了公認(rèn)的纖維化反應(yīng)的牛物標(biāo)志物 a -SMA的表達(dá)。
[0047] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果被表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)，并被繪制成條形圖。使用t_檢驗(yàn)來(lái) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。[*:P〈0.05]
[0048] 圖5.在活化的hHSC中用式（I)的化合物處理誘導(dǎo)了話度的促凋亡反應(yīng)并顯著增 強(qiáng)十字孢堿的促凋亡效果
[0049] 在hHSC中，評(píng)估了單獨(dú)或與廣譜蛋白激酶抑制劑十字孢堿組合的式（I)的化合物 的促凋亡性質(zhì)。首先將HSC暴露于去血清培養(yǎng)16小時(shí)，隨后用單獨(dú)的式（I)的化合物或式 (I)的化合物與十字孢堿的組合進(jìn)行處理。使用Caspase-Glo? 3/7活性測(cè)定試劑盒評(píng)估 這些處理的促凋亡效果。
[0050]實(shí)驗(yàn)結(jié)果被表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)，并被繪制成條形圖。利用Sigma Plot 11. 0軟件，使用不配對(duì)雙因素AN0VA，然后使用Bonferroni事后檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0051] [* :p〈0. 05 ;** :p〈0. 01 ;*** :p〈0. 001 (與"十字孢堿 0? 3 y M" 組的比較）
[0052] 車;p〈0. 05 ; p〈0. 01 ;抑知p〈0. 001 ( "無(wú)十字孢堿"組的比較）]
[0053] 發(fā)明詳述
[0054] 本發(fā)明涉及化合物1- [4-甲基硫苯基]-3- [3, 5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基 苯基]丙-2-烯-1-酮在治療纖維化和癌癥中的用途，這樣的化合物能夠以出人意料的方 式降低負(fù)責(zé)纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)的形成的主要細(xì)胞類型，即人類成纖維細(xì)胞（包括星狀細(xì) 胞）的增殖和活化。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明使用的化合物1_[4_甲基硫苯基]_3_[3, 5-二甲基-4-羧基二甲基甲 氧基苯基]丙-2-烯-1-酮為下式（I)的化合物
[0056]
[0057] 現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有教導(dǎo)1_[4_甲基硫苯基]_3_[3, 5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯 基]丙-2-烯-1-酮由于直接和/或間接抑制受體酪氨酸激酶而具有抗纖維化或抗癌效果。
[0058] 因此，本發(fā)明涉及化合物1_[4_甲基硫苯基]_3_[3, 5-二甲基-4-羧基二甲基甲 氧基苯基]丙-2-烯-1-酮，其用于治療或預(yù)防纖維化疾病的方法中，或用于治療或預(yù)防與 酪氨酸激酶相關(guān)的癌癥的方法中，其中所述纖維化疾病不是肝纖維化。
[0059] 另一方面，本發(fā)明涉及式（I)的化合物，其用于抑制負(fù)責(zé)膠原纖維生產(chǎn)和/或負(fù)責(zé) 細(xì)胞外基質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞的增殖和/或活化。
[0060] 本發(fā)明還涉及式（I)的化合物，其用于促進(jìn)負(fù)責(zé)膠原纖維生產(chǎn)和/或負(fù)責(zé)細(xì)胞外 基質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞的凋亡。
[0061] 根據(jù)本發(fā)