進行發(fā)光成像，從而確定小鼠腹膜內(nèi)的SK0V3細胞轉移的圖像。
[0125]SK0V3細胞是來源于卵巢癌患者腹水的上皮細胞(更多信息參見http://www.atcc.0rg/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx ?ATCCN um = HTB_77&Template = cellB1logy)。
[0126]小鼠為6-8周患重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的雌鼠。
[0127]本發(fā)明的目的是提供一種可以捕獲腫瘤細胞的制品/誘捕裝置。該制品或誘捕裝置可以作為一種有效的吸引腫瘤細胞的信號發(fā)射器。該制品可以對腫瘤細胞進行誘捕，通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞播散，該制品(誘捕裝置)能防止在不期望的位置產(chǎn)生轉移灶。
[0128]參考以下附圖，通過實施例，對本發(fā)明進行更詳細地進一步說明:
[0129]結果
[0130]卵巢癌模型
[0131]本文提供的數(shù)據(jù)表明在模擬腫瘤播散的卵巢癌模型中，本發(fā)明的制品/誘捕裝置可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的轉移。在該模型中，向小鼠腹腔內(nèi)注入1x106SK0V3卵巢癌細胞，并在注射I周后，在胰腺和性腺脂肪處產(chǎn)生可繁殖的轉移圖像(reproducible pattern ofmetastasis)(圖1)。
[0132]本發(fā)明用來捕獲/誘捕轉移性腫瘤細胞的制品包含具有納米網(wǎng)孔的3D插入件(3DInsertTM-PS with Nanomesh)組織培養(yǎng)支架(3D B1tek, New Jersey, USA)，該支架包含50g從卵巢癌患者腹水中分離純化的外來體(圖2)。
[0133]在博伊登室體外迀移試驗中，對外來體吸引和捕獲SK0V3細胞的能力進行了驗證。簡單地說，50，000SK0V3細胞種植到博伊登室上部的小室，外來體則放入下部的小室。24小時孵育后，由于外來體的梯度化學引誘梯度，通過多孔膜轉移的SK0V3細胞數(shù)被定量測定。如圖3所示，相比于對照的未含有任何化學引誘物的培養(yǎng)液，外來體可以非常有效地吸引SK0V3細胞。從這些結果我們可以得出，外來體是對腫瘤細胞有效的化學引誘物，并能捕獲被吸引的細胞。
[0134]利用動物模型，在體內(nèi)證實了外來體捕獲SK0V3細胞的能力，其中，本發(fā)明的制品或M-trap包含支架和外來體。這些試驗表明本發(fā)明的制品能夠誘捕轉移性腫瘤細胞。試驗中，向小鼠腹腔內(nèi)注入IxlO6表達熒光素酶報告基因的SK0V3細胞，以監(jiān)測注射的效率和體內(nèi)隨之發(fā)生的轉移情況。在小鼠對側腹壁注入含有或不含有外來體的支架。本模型中，胰腺被認為是一個自然的轉移灶。通過剖腹手術在小鼠腹膜上植入含有外來體的支架，并用手術用膠(SurgySeal Fibrin Sealant System ;B1STAR, Toronto, Canada)貼于腹膜，手術一周后，向小鼠體內(nèi)注入SK0V3細胞。如圖5所示，注入腹腔內(nèi)的SK0V3細胞在胰腺和性腺脂肪處(圖5A)產(chǎn)生了轉移灶，而在包含有作為化學引誘物和/或捕獲劑的外來體的支架/誘捕裝置中或其周圍發(fā)現(xiàn)了獨特的SK0V3細胞定位。
[0135]這些結果表明本發(fā)明的誘捕裝置/制品能夠干擾腫瘤細胞的播散，并能吸引和誘捕腫瘤細胞到特定的位置中，從而防止腫瘤細胞轉移。
[0136]為了進一步證實不使用支架的情況下外來體吸引和誘捕腫瘤細胞并通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞播散來防止轉移灶產(chǎn)生的效力，在小鼠性腺脂肪內(nèi)注入外來體，形成一種體內(nèi)卵巢癌轉移播散的模型。為此，用1001 PBS重懸從卵巢癌患者腹水中提純的外來體(15mg外來體/ml)，通過腹膜手術向小鼠子宮底部的脂肪(圖6A中的性腺脂肪)內(nèi)注入外來體溶液。這種情況下，脂肪代表了運載外來體的載體。I周后，在腹腔內(nèi)注入1x106SK0V3細胞，再I周后，殺死小鼠并分析轉移的圖像。如圖6B所示，位于性腺脂肪的外來體能夠吸引和誘捕SK0V3細胞，消除胰腺上的轉移灶(見圖5A或7B中的正常的SK0V3細胞播散圖像)。當純化的外來體被嵌入一種能為外來體提供半固體黏稠度的細胞外基質(zhì)MatrigelTM(圖6C)時會出現(xiàn)同樣的結果；含有外來體的Matrigel可以作為含有外來體的支架的替換。
[0137]為了評估本發(fā)明的制品/誘捕裝置使用其他調(diào)節(jié)腫瘤細胞播散的藥劑來吸引和/或誘捕腫瘤細胞的有效性，作為外來體的替換，將間充質(zhì)干細胞(MSCs)種植于三維支架來制備制品。為了檢測MSCs細胞調(diào)節(jié)腫瘤性細胞播散的能力，在包含有50，000動物脂肪來源的MSCs種植于3D B1tek支架從而制成誘捕裝置，24h后將該裝置植入小鼠腹壁(圖7A)。如同前述試驗一樣，在植入該替代制品7天后，向小鼠腹腔內(nèi)注入1x106SK0V3細胞，再一周后殺死小鼠，并分析轉移播散的圖像。如前述附圖所示，在這個小鼠模型中，SKV03細胞正常播散的圖像包括了在胰腺和性腺脂肪的轉移灶(圖7B)。然而包含MSCs的三維支架制成的制品可以有效地吸引SK0V3細胞(圖7C)。這些結果都證實了用不同的調(diào)節(jié)腫瘤細胞播散的藥劑的制品/誘捕裝置來捕獲轉移性腫瘤細胞的能力。
[0138]結腸和子宮內(nèi)膜癌模型
[0139]為了評估本發(fā)明制品/誘捕裝置獨立于癌癥類型來調(diào)節(jié)腫瘤細胞播散的有效性，用非卵巢癌細胞的結腸腫瘤細胞(HCT116)和子宮內(nèi)膜來源的Ishikawa腫瘤細胞來重現(xiàn)了3D B1tek支架和外來體的試驗。這兩種類型的癌癥也代表了腹膜內(nèi)腫瘤細胞的播散。
[0140]如圖5、圖7所述，含有外來體的支架被植入胰腺對側的腹壁上。手術I周后，IxlO6個穩(wěn)定地表達熒光素酶報告基因的HCTl 16或Ishikawa細胞被注入腹腔內(nèi)，7天后殺死小鼠，用發(fā)光法分析腫瘤細胞播散和腹膜轉移的圖像。平行對照試驗為不使用支架而將HCTl 16或Ishikara細胞注入小鼠中，以證明正常的轉移圖像。如圖8所示，結腸HCT116腫瘤細胞主要轉移至胰腺和肝臟(圖8A)，而子宮內(nèi)膜Ishikawa腫瘤細胞則優(yōu)先在胰腺中出現(xiàn)獨特的轉移灶(圖SC)。在用SK0V3卵巢癌細胞的試驗中發(fā)現(xiàn)，在這些模型中，胰腺代表了與腹膜播散有關的被優(yōu)先選擇的轉移位點。另外，細胞型特定的趨化性包括了卵巢癌細胞趨向性腺脂肪，而結腸腫瘤細胞趨向肝臟。
[0141 ] 正如卵巢癌，在小鼠植入含有外來體的支架的情況下，注入HCTl 16和Ishikawa細胞可以完全調(diào)節(jié)轉移播散的圖像。絕大部分腫瘤細胞位于支架內(nèi)或其周圍，表明了由含有作為化學引誘物的外來體的三維支架構成的捕獲裝置有效吸引和捕獲HCTl 16結腸癌細胞(圖8B)和Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細胞(圖8D)的能力。這些結果說明本發(fā)明的制品和/誘捕裝置能夠吸引和捕獲轉移性腫瘤細胞，而與癌癥類型無關。
[0142]本發(fā)明的制品可以作為一種植入和有效捕獲腹膜轉移性細胞的優(yōu)先的生態(tài)位
[0143]為了證實本發(fā)明的制品，如M-Trap (—種如前所述的用外來體裝飾的3D B1tek支架)是否也可以作為一種非藥理裝置，并且為了證明該制品的一種作用方式是支持轉移性腫瘤細胞的優(yōu)先的移植(或捕獲)，在體外和體內(nèi)進行了細胞黏附試驗。首先，短期黏附試驗如下:將鈣黃綠素標記的SK0V3細胞種植在用與M-Trap支架相同的聚苯乙烯材料制成的孔中，37°C孵育Ih后，洗滌，然后對黏附于孔底部的SK0V3細胞用熒光法定量。如圖1OA所示，在孔底部用外來體裝飾后，SK0V3細胞表現(xiàn)出更大的黏附能力。此外，之前所描述的用來調(diào)節(jié)細胞黏附的兩種外來體蛋白，即四跨膜蛋白CD9和CD81的抗體可以部分地去除SK0V3細胞對外來體的黏附，說明了外來體在調(diào)節(jié)SK0V3細胞黏附方面的特定作用(圖10A)。接下來，為了在體外模仿在重力作用下腹腔內(nèi)的腹水自然流動到它最依賴的位置，并為分散的腫瘤細胞腹膜種植性播散提供通路(Tan et al., Lancet Oncol.2006 ；7:925-34)，在軌道運動條件下評估SK0V3細胞對M-Trap裝置的黏附(圖10B)。在這些動態(tài)條件下，與空支架和用polyhema預處理以防黏附的空支架相比，SK0V3細胞在存在外來體時優(yōu)先選擇地移植能力得到增強(圖10B)。此外，可以用CD9和CD81蛋白裝飾空支架以提到捕獲SK0V3細胞的能力(圖10B)，而用抗CD9和CD81抗體阻斷外來體可以減弱M-Trap的捕獲能力(圖10B)。另外，用這兩種蛋白裝飾空支架提到其黏附性能時有劑量依賴，這與外來體的數(shù)量增加類似(圖10C)。最后，通過用灌注條件為7501/min的恒定流速將腫瘤細胞懸浮液栗入事先放入支架的小室內(nèi)，進一步研究SK0V3細胞對用或未用polyhema預處理的支架以及M-Trap的動態(tài)黏附。如圖1OD所示，可以通過外來體來進一步提高由支架性能決定的對SKOV3細胞的基礎捕獲能力。從這些結果可以得出，M-Trap通過捕獲腫瘤細胞的方式實現(xiàn)其黏附能力；SKOV3細胞黏附到3D B1tek支架的基礎能力可以通過純化的外來體和核外黏附蛋白CD9和CD81兩種方式實現(xiàn)。另外，模仿在卵巢癌轉移中腹腔內(nèi)存在的種植性播散的軌道流動可能促進轉移性腫瘤細胞通過并與M-Trap聯(lián)系，從而提高誘捕裝置的效率。
[0144]一旦在體外試驗特點明確，在小鼠模型體內(nèi)注入SK0V3細胞以模擬卵巢癌細胞播散和腹膜轉移，進行了 M-Trap的作用模式轉化的試驗。其中，M-Trap通過手術方式植入與胰腺相對的腹膜內(nèi)壁(圖1lA方案)，一周后向小鼠體內(nèi)注入IxlO6個穩(wěn)定表達熒光素酶報告基因的SK0V3細胞。在腹腔注射I周后，殺死小鼠，通過生物熒光實驗評估播散圖像。在無支架存在的情況下，腹膜轉移圖像主要在胰腺和性腺脂肪處出現(xiàn)兩個轉移灶(圖11B)。相反地，在不包含外來體的空支架存在的情況下，在支架內(nèi)出現(xiàn)了 SK0V3細胞的另一個轉移灶(圖11C)，從而可以解釋為在體內(nèi)模型試驗中，支架具有黏附轉移腫瘤細胞的能力。轉移性卵巢癌細胞播散可以顯著地完全被M-Trap裝置重塑/調(diào)節(jié)，從而使常規(guī)轉移位點消失而在含有外來體的支架內(nèi)出現(xiàn)一個獨特的轉移灶(圖11D)。
[0145]此外，當用polyhema預處理后，空支架的黏附能力被限制，可以觀察到捕獲轉移性SK0V3細胞的能力降低(圖12A)。相反地，當用四跨膜蛋白CD81裝飾支架時能提高支架的黏附能力，胰腺轉移的消除證實了支架捕獲SK0V3細胞能力的提高(圖12B)。在用四跨膜蛋白CD9裝飾支架時也可以得到同樣的結果(數(shù)據(jù)未列出)。與體外試驗數(shù)據(jù)類似，從這些結果可以得出，支架的捕獲能力按以下順序逐漸上升，用polyhema預處理的支架后可能由于異物炎癥反應而表現(xiàn)出殘余的黏附能力、植入的三維B1tek支架具有相當?shù)酿じ侥芰Α⒂盟目缒さ鞍證D9或CD81修飾的支架黏附能力進一步提高、純化的外來體可以完全重塑轉移的圖像。總之，這些結果轉移到卵巢癌腹膜轉移的小鼠模型上時，證明了本發(fā)明的M-Trap或誘捕裝置捕獲播散的腫瘤細胞的能力，其中誘捕裝置主要是作為一種有效的、人造轉移前的生態(tài)位，在與自然轉移植入位點競爭的情況下，可以使循環(huán)在腹膜的轉移性腫瘤細胞能優(yōu)先選擇黏附。
[0146]圖14進一步證實了本發(fā)明的誘捕裝置在小鼠模型中捕獲通過腹膜播散的轉移性SK0V3細胞