一種三七和淫羊藿提取物的混合制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一下三七和淫羊藿提取物的混合制劑在制備延緩心臟衰老的藥物上 的應(yīng)用，屬于藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)今社會(huì)，老年人心血管疾病的發(fā)病率和死亡率日益增加，嚴(yán)重威脅著老年人的 健康。研究表明：隨著年齡的增加，老年心臟呈現(xiàn)出左心室壁肥厚、纖維化增加，進(jìn)而導(dǎo)致舒 張功能及射血功能障礙等，進(jìn)一步加劇心血管疾病的發(fā)生。臨床研究表明：72-91歲的老年 人左心室壁厚度增加，舒張期充盈度降低，主動(dòng)脈僵硬度增加。因此延緩心臟衰老是當(dāng)今迫 切解決的問(wèn)題。
[0003] 線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的場(chǎng)所，同時(shí)也是細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，R0S)的場(chǎng)所。"自由基與線粒體衰老理論"是研究者們普遍認(rèn)可衰老理論。線 粒體在病理?xiàng)l件下，電子傳遞出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS增加，進(jìn)一步損傷線粒體膜以及 mtDNA等形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致線粒體衰老。心臟是耗能最多的器官之一，因此心臟中 含有大量的線粒體。新近研究表明：線粒體結(jié)構(gòu)與功能損傷是導(dǎo)致心臟衰老的重要原因之 一。研究表明：老齡心肌表現(xiàn)出線粒體內(nèi)膜通透性增加，電子漏、呼吸功能減退以及mtDNA 突變。
[0004] 沉默信息調(diào)節(jié)因子 2 (Silent information regulator 2, Sir2)是 NAD+依賴(lài)的組 蛋白去乙?；福℉DAC)家族成員之一，其能調(diào)控酵母、蠕蟲(chóng)和果蠅的生命周期，具有組蛋 白去乙?；富钚?，哺乳動(dòng)物沉默信息調(diào)節(jié)因子2蛋白（silent information regulator 2protein，Sirtuin)家族基因與Sir2基因高度同源。新近研究表明：Sirtuin家族成員 中SIRT1，SIRT3與線粒體結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)。SIRTl去乙?；?xì)胞內(nèi)多種因子：p53, Ku70蛋 白（Ku70)等，調(diào)控線粒體的發(fā)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老等生物過(guò)程。PGC-Ia (Peroxisoma proliferatoractivated receptor-coactivator Ia，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 γ 輔 酶活因子I a )在線粒體生物發(fā)生中發(fā)揮很重要的作用。研究表明：白藜蘆醇通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞 中SIRTl，PGC-la的激活，促進(jìn)線粒體生物合成從而延緩細(xì)胞衰老。SIRT3在心臟、肌肉等 組織中高表達(dá)。小分子的SIRT3定位于線粒體內(nèi)膜。研究表明在鹽敏感大鼠誘發(fā)的心臟衰 老模型中線粒體脫乙酰酶SIRT3蛋白減少，第一次表明了心臟衰老中線粒體蛋白的乙?；?與SIRT3有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種三七和淫羊藿提取物的混合制劑在制備延緩心臟衰 老的藥物上的應(yīng)用。
[0006] 所述的三七提取物為三七總皂苷（TPNS)，所述的淫羊藿的提取物為淫羊藿總黃酮 (TFE)〇
[0007] 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮的重量比為0. 2-5 :1。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選為三七總皂苷與淫羊藿總黃酮的重量比為1 :1。
[0009] 三七總皂苷（TPNS)與淫羊藿總黃酮（TFE)的聯(lián)合具有對(duì)衰老H9c2心肌細(xì)胞活力 明顯增加；能顯著減少β -半乳糖苷酶染色的陽(yáng)性率，降低MDA含量；對(duì)衰老的H9c2心肌細(xì) 胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度顯著降低；對(duì)衰老的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位顯著增強(qiáng)；對(duì)衰老 的H9c2心肌細(xì)胞中的SIRT1，PGC-I a，SIRT3蛋白表達(dá)量顯著增加。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖I TPNS聯(lián)合TFE對(duì)衰老H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)β -半乳糖苷酶活性的影響注：
[0011] Con :正常組；D-gal :D-半乳糖組；TPNS :5 μ g/mL三七總皂苷單劑量組；TFE : 5 μ g/mL淫羊藿總黃酮單劑量組；TPNS+TFE :5 μ g/mL三七總皂苷聯(lián)合5 μ g/mL淫羊藿總黃 酮組。
[0012] 圖2 TPNS聯(lián)合TFE對(duì)衰老H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，其中，2-1為ROS熒光強(qiáng) 度代表圖，2-2為平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。
[0013] 注：Con :正常組；D-gal :D-半乳糖組；TPNS :5 μ g/mL三七總皂苷單劑量組；TFE : 5 μ g/mL淫羊藿總黃酮單劑量組；TPNS+TFE :5 μ g/mL三七總皂苷聯(lián)合5 μ g/mL淫羊藿總黃 酮組，aP < 〇· 05, vs 正常組；*P < 0· 05, vs D-半乳糖組；&P < 0· 05, vs 5 μ g/mL TPNS ;#P < 0. 05, vs 5 μ g/mL TFE。
[0014] 圖3 TPNS聯(lián)合TFE對(duì)衰老H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響。
[0015] 注：Con :正常組；D-gal :D-半乳糖組；TPNS :5 μ g/mL三七總皂苷單劑量組；TFE : 5 μ g/mL淫羊藿總黃酮單劑量組；TPNS+TFE :5 μ g/mL三七總皂苷聯(lián)合5 μ g/mL淫羊藿總黃 酮組。
[0016] 圖4 TPNS聯(lián)合TFE對(duì)衰老H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)SIRT1，PGC-Ia，SIRT3蛋白表達(dá) 量的影響注：4-1蛋白免疫印跡的代表圖4-2:Sirtl (沉默信息調(diào)節(jié)因子1)蛋白的統(tǒng)計(jì) 結(jié)果4-3:PGC-la (過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔酶活因子la)蛋白的統(tǒng)計(jì)結(jié)果 4-4:Sirt3(沉默信息調(diào)節(jié)因子3)蛋白的統(tǒng)計(jì)結(jié)果1?<0. 05, vs正常組；*P<0. 05, vs D-半乳糖組；&P < 0· 05, vs 5 μ g/mL TPNS ;#P < 0· 05, vs 5 μ g/mL TFE。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1
[0018] 本發(fā)明中，細(xì)胞株H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)置于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞 庫(kù)。TPNS購(gòu)于成都指標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，純度> 95 %。TFE購(gòu)于成都仁城生物科技有 限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 %。高糖D-半乳糖（Sigma公司）。高糖DMEM (GIBC0公司，884684)。 胰蛋白酶（GIBC0公司，EC2901)。胎牛血清（GIBC0公司，10099141)，活性氧檢測(cè)試劑盒（普 利萊基因技術(shù)有限公司，C1300)，四甲基偶氮唑鹽（Sigma公司，03285-1KT-F)。細(xì)胞衰老 特異性β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，GMS10012. 1); BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，Ρ1511)，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 (碧云天生物技術(shù)研究所，C2005)?；钚匝鯔z測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，S0033); SIRT3 抗體（Millipore, 2199719)。SIRTl 抗體（Millipore, 2465249) ;0-actin(谷歌生 物，GB13001)。PGC-I a (Santa Cruz, sc-13067) 〇
[0019] 具體方法：
[0020] 細(xì)胞培養(yǎng)：H9c2細(xì)胞用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將其放置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0021] MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：
[0022] H9c2細(xì)胞懸液以5X103個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100yL，設(shè)置8組：⑴正 常組；（2)D-半乳糖組（50mmol/L) ; (3)TPNS單藥組（終濃度分別為5、25 μ g/mL) ; (4)TFE 單藥組（終濃度分別為5、25 μ g/mL) ; (5) PNS (5 μ g/mL)聯(lián)合TFE (5 μ g/mL)用藥組；（6) PNS (5 μ g/mL)聯(lián)合 TFE (25 μ g/mL)用藥組；（7) PNS (25 μ g/mL)聯(lián)合 TFE (5 μ g/mL)用藥組； (8) PNS (25 μ g/mL)聯(lián)合TFE (25 μ g/mL)用藥組。每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。藥物作用24h后棄 去上清液，每孔加入終濃度為0. 5mg/L MTT的培養(yǎng)基100 μ L，培養(yǎng)4h后，離心棄去上清液， 每孔加入150 μ L DMS0,震蕩IOmin至結(jié)晶完全溶解，立即放置在波長(zhǎng)于490nm的酶標(biāo)儀中 檢測(cè)其吸光度A。
[0023] β -半乳糖苷酶檢測(cè)細(xì)胞衰老程度：
[0024] H9c2細(xì)胞懸液接以I X IO5個(gè)/mL接種于24孔板中，每孔ImL,分別加入 TPNS (5 μ g/mL)單藥；TFE (5 μ g/mL)單藥以及 TPNS (5 μ g/mL)聯(lián)合 TFE (5 μ g/mL)用藥組， 每孔設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，作用24h后，棄去上清液，每孔加入500 μ L的清理液清理細(xì)胞表面，棄 去清理液，每孔中加入500 μ L的固定液，室溫孵育5分鐘后，棄去固定液，每孔加入500 μ L 的酸性液清洗細(xì)胞表面，棄去酸性液，每孔加入400 μ L提前預(yù)熱的染色工作液，在37°C恒 溫箱孵育3到16小時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染成藍(lán)色的情況