Lect2多肽、lect2蛋白在制備動(dòng)員造血干/祖細(xì)胞藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及LECT2蛋白、LECT2多肽的應(yīng)用，及LECT2蛋白、LECT2多肽中的氨基酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002]造血干/祖細(xì)胞移植經(jīng)常被用于治療多種疾病，增加造血干/祖細(xì)胞在骨髓的增殖并且動(dòng)員它們進(jìn)入血液對(duì)于造血干/祖細(xì)胞移植非常重要。造血干/祖細(xì)胞療法目前是腫瘤、中風(fēng)、阿爾茲海默癥等許多疾病的重要治療手段。收集血液中的干細(xì)胞可以用于異體干細(xì)胞移植或者短暫保存以后用于自體干細(xì)胞移植。上述干細(xì)胞療法均需要?jiǎng)訂T骨髓中的干細(xì)胞，使其由骨髓進(jìn)入到血液中。造血干/祖細(xì)胞(HSPC)在骨髓和血液中經(jīng)歷滯留(retent1n)、動(dòng)員(mobilizat1n)和歸巢(homing)三種運(yùn)動(dòng)。在粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)作用下，HSPC將被動(dòng)員激活增殖，最終由骨髓迀移到血液。這個(gè)過程已經(jīng)被臨床上用于收集骨髓造血干/祖細(xì)胞用于多種疾病的治療。目前臨床上，僅有G-CSF、GM-CSF和AMD3100等極少數(shù)的藥物被用于動(dòng)員HSPC，而其它動(dòng)員藥物在臨床試驗(yàn)中多因?yàn)閺?qiáng)烈的副作用或效果較差而失敗，比如SCF可誘發(fā)血管性水腫、風(fēng)疹等疾病。即使G-CSF已經(jīng)成為最常用的HSPC動(dòng)員藥物，臨床使用中也發(fā)現(xiàn)存在一定副作用，比如會(huì)引起骨痛、重度再生障礙性貧血和中性白細(xì)胞減少癥。而且5-30%的病人在所有目前臨床上使用的動(dòng)員藥物使用之后，仍然無法動(dòng)員足夠的HSPC進(jìn)入血液。因此臨床上急需開發(fā)新的HSPC動(dòng)員藥物。
[0003]白細(xì)胞衍生趨化因子(leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2 蛋白)是一個(gè)多功能的蛋白質(zhì)，分子量約為16 kDa，含三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，該分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無糖基修飾。LECT2 —開始被認(rèn)為是一種嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)它還與骨骼和血管生長(zhǎng)、肝移植損傷修復(fù)、植物毒素、非病原抗原等引起的病理和生理過程有關(guān)，如公布號(hào)為CN102159238名稱為抑制病理性血管發(fā)生作用的組合物的中國(guó)專利文獻(xiàn)，就公開了包括有效量的LECT2蛋白制備成抑制病理性血管發(fā)生作用和/或細(xì)胞增生性疾病的組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是提供LECT2多肽在制備促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員藥物中的應(yīng)用。所述LECT2多肽通過上調(diào)骨髓中的造血干/祖細(xì)胞，將其動(dòng)員到血液中，引起血液中造血干/祖細(xì)胞數(shù)目的增多，并且引起血液中造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的集落形成單位(CFU-C)數(shù)量的增多。
[0005]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了 LECT2多肽在制備促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加藥物中的應(yīng)用。
[0006]所述LECT2多肽包含下列氨基酸序列組成:PWANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDILCSAGSTVYAPF，可以依據(jù) Ovejero 等公開的 “Identificat1n of the leukocytecell-derived chemotaxin 2 as a direct target gene of beta-catenin in the liver，，(Hepatology, 2004年7月、40 (I)，167-176 )方法進(jìn)行制備。所述LECT2蛋白(登錄序列號(hào)NM_002302)為氨基酸全長(zhǎng)序列，也用上述方法制備?？梢栽趧?dòng)物細(xì)胞、低等真核生物或原核生物中重組表達(dá)，如在酵母菌中表達(dá)得到重組LECT2多肽，或在大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等原核生物進(jìn)行表達(dá)得到重組LECT2多肽。此外，還可以采用固相合成的方法合成LECT2多肽。
[0007]本發(fā)明還提供了 LECT2蛋白在制備促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員藥物中的應(yīng)用。所述LECT2蛋白通過上調(diào)骨髓中的造血干/祖細(xì)胞，將其動(dòng)員到血液中，引起血液中造血干/祖細(xì)胞數(shù)目的增多，并且引起血液中造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的集落形成單位(CFU-C)數(shù)量的增多。
[0008]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了 LECT2蛋白在制備促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加藥物中的應(yīng)用。
[0009]LECT2蛋白、LECT2多肽制備的藥物，可以是純LECT2多肽制劑、LECT2蛋白制劑，也可以是LECT2多肽、LECT2蛋白與藥學(xué)上可接受的載體組成的各種制劑，如注射劑、口服液、丸劑、片劑、膠囊等，這些藥學(xué)上可接受的載體可以是:所述載體材料包括填充劑、崩解劑、潤(rùn)濕劑、粘合劑、泡騰劑、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、矯嗅劑、著色劑以及其他種類的固體制劑的賦形劑。
[0010]本發(fā)明的LECT2多肽的給藥途徑可以是口服、非腸胃吸入、直腸、陰道、皮內(nèi)、經(jīng)皮或局部給予；本發(fā)明的LECT2蛋白、LECT2多肽可一次給予或24小時(shí)內(nèi)多次給予或連續(xù)給予，劑量可以為每天純LECT2多肽0.02 -2 μ g /g體重。
[0011]本發(fā)明中的LECT2多肽、LECT2蛋白含有以下氨基酸序列:PWANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDILCSAGSTVYAPF。
[0012]由于某些氨基酸成份的改變并不影響多肽或者蛋白的活性，LECT2蛋白、LECT2多肽的修飾或改造產(chǎn)物如果存在與上述序列存在60%以上的氨基酸序列相似性可被視同LECT2多肽、視同LECT2蛋白。
[0013]經(jīng)試驗(yàn)檢驗(yàn)，LECT2多肽、LECT2蛋白連續(xù)皮下注射3天可引起骨髓造血干/祖細(xì)胞數(shù)目顯著上調(diào)，LECT2、LECT2蛋白多肽連續(xù)注射達(dá)到5天，可引起血液中的CFU-C數(shù)目顯著增高，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)血液中實(shí)際的造血干/祖細(xì)胞數(shù)目顯著上調(diào)，LECT2多肽、LECT2蛋白在增加和動(dòng)員骨髓造血干/祖細(xì)胞中的應(yīng)用，LECT2多肽、LECT2蛋白在促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員藥物中、在促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加中具有極其顯著的效果。
【附圖說明】
[0014]圖1為L(zhǎng)ECT2多肽增加和動(dòng)員骨髓造血干/祖細(xì)胞的示意圖；
圖2為L(zhǎng)ECT2多肽和LECT2蛋白增加血液中CFU-C數(shù)目的直方圖，*代0.05 vs O h組；A:LECT2多肽處理后血液中CFU-C的數(shù)目，B:LECT2蛋白處理后血液中CFU-C的數(shù)目。
[0015]圖3為采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)造血干/祖細(xì)胞的方法的散點(diǎn)圖，圖中Lineage Sca-l+c-Kit+細(xì)胞(LSK)為造血干祖細(xì)胞(HSPC)；
圖4為L(zhǎng)ECT2多肽和LECT2蛋白引起血液中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加的直方圖；其中，A: LECT2多肽處理后每ml血液的白細(xì)胞數(shù)，B:LECT2多肽處理后每ml血液的LSK，C:LECT2蛋白處理后每ml血液的LSK。*代0.05 vs O h組。
[0016]圖5為L(zhǎng)ECT2多肽引起骨髓中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加的直方圖；其中，A:LECT2多肽處理后每根股骨的白細(xì)胞數(shù)。B:LECT2多肽處理后每百萬骨髓細(xì)胞的LSK。C:LECT2蛋白處理后每百萬骨髓細(xì)胞的LSK。*代0.05 vs O h組。
[0017]圖6 G-CSF不介導(dǎo)LECT2多肽對(duì)血液造血干/祖細(xì)胞的增加效果。*代0.05 vsPBS 組，#代0.05 vs G-CSF 組。
[0018]圖7抗腫瘤藥或輻射后LECT2多肽和G-CSF注射對(duì)血液造血干/祖細(xì)胞數(shù)量的影響。其中，A，Doxorubicin使用后LECT2多肽比G-CSF具有更強(qiáng)的促血液造血干/祖細(xì)胞的增加效果。B，小鼠輻射后(6 Gy) LECT2多肽比G-CSF具有更強(qiáng)的促血液造血干/祖細(xì)胞的增加效果。*K0.05 vs PBS 組，#Κ0.05 vs G-CSF 組。
[0019]圖8 LECT2多肽和G-CSF注射對(duì)小鼠骨痛的影響。A，注射后小鼠右后足行走評(píng)分的變化。B，注射后小鼠右后足機(jī)械縮足反射閾值的變化。*八0.05。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0021 ] 實(shí)施例1，LECT2多肽的分析
根據(jù)對(duì)人類LECT2氨基酸序列的分析，找到LECT2的核心功能區(qū)。序列組成為: PffANICAGKSSNEIRTCDRHGCGQYSAQRSQRPHQGVDILCSAGSTVYAPF。
經(jīng)過分析該序列的分子量為5.51 kDa，等電點(diǎn)為8.21。該序列在6_41和17-22分別擁有二硫鍵連接。
[0022]實(shí)施例2，LECT2多肽、LECT2蛋白影響集落形成
證明LECT2多肽引起造血干/祖細(xì)胞數(shù)量增加和動(dòng)員的方法如圖1所示。采用LECT2多肽溶于PBS(200 μ g/kg/d)，每天一次，皮下注射小鼠，心臟取血收集注射以后O h，24 h，3 d和5 d血液，進(jìn)行CFU-C分析。LECT2蛋白溶于PBS(200 μ g/kg/d)，皮下注射小鼠，每天一次，5 d后收集血液，進(jìn)行CFU-C分析。全血1500 rpm離心5 min去除上清，用PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)icoll密度梯度離心，收集白膜層。用胎盼藍(lán)染色血液細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)儀算出各個(gè)樣品中的外周血白膜層細(xì)胞的數(shù)量。
[0023]將血液白膜層細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸(MDM，2%FBS)。每個(gè)35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿加入2X 15外周血白膜層細(xì)胞(溶于0.3 ml培養(yǎng)基)。0.3 ml細(xì)胞加入到3 ml的甲基纖維素培養(yǎng)基(MethoCult, StemCell,美國(guó))。每個(gè)35 mm培養(yǎng)皿鋪1.1 ml細(xì)胞和培養(yǎng)基混合物。每2個(gè)35 mm培養(yǎng)皿置于一個(gè)100 mm的大培養(yǎng)皿中，另加一個(gè)裝有3 ml雙蒸水的35mm培養(yǎng)皿，保持濕度。
[0024]細(xì)胞于37° C，5%0)2環(huán)境培養(yǎng)14天。然后顯微鏡下檢測(cè)CFU-C生成的數(shù)量。結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)LECT2多肽注射