長非編碼核糖核酸uc.48+小干擾RNA在制備糖尿病及并發(fā)疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及糖尿病藥物用途發(fā)明領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿?。―iabetes Mellitus，DM)是一組代謝性臨床綜合征，隨著社會(huì)的發(fā)展和 人們生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在發(fā)達(dá)國家糖尿病患病率已達(dá)3% -7%， 成為僅次于癌癥、艾滋病、心腦血管病之后第4位需要優(yōu)先考慮的疾病，已成為世界第5位 死亡主因。糖尿病分為1型（胰島素依賴性）和2型（非胰島素依賴性）糖尿病，不論是 1型（胰島素依賴性）還是2型（非胰島素依賴性）糖尿病，其最主要的癥狀便是高血糖。 高血糖是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的主要原因，據(jù)估計(jì)，全球六個(gè)人里面就有一個(gè)人處于患糖尿 病并發(fā)癥的危險(xiǎn)中。我國糖尿病人群的構(gòu)成以2型糖尿病為主，占糖尿病人群的90%以上， 嚴(yán)重影響著人民健康和社會(huì)發(fā)展。
[0003] 葡萄糖激酶（glucokinase，GK)己糖激酶家族中的一員，分子質(zhì)量為52k，由448個(gè) 氨基酸殘基構(gòu)成。GK是糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，特異性地存在于胰腺β細(xì)胞和肝細(xì)胞，可 促進(jìn)胰島素分泌和葡萄糖代謝，參與糖代謝的各條途徑。GK具有雙重的生物學(xué)功能，肝臟 GK參與葡萄糖磷酸化，加速糖原合成及葡萄糖代謝；胰腺β細(xì)胞中GK為葡萄糖敏感器，可 促進(jìn)高濃度葡萄糖狀態(tài)下胰島β細(xì)胞分泌胰島素來降低血糖。肝臟中的GK是糖酵解過程 中第一步的限速酶，催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，后者在胰島素作用下經(jīng)過糖原 合成途徑合成肝糖原儲存起來。因此，肝臟中的GK的主要作用是促進(jìn)糖酵解，加速糖原合 成和抑制糖異生，控制肝細(xì)胞對葡萄糖的攝取與利用，從而有效控制體內(nèi)血糖平衡。研究表 明，普通糖尿病患者及糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)葡萄糖激酶活性明顯降低，它可能對糖尿病的 發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響，而增加 GK活性可促進(jìn)葡萄糖的磷酸化，促進(jìn)糖原合成和胰島素 釋放，從而改善糖耐量異常，提高胰島細(xì)胞功能，改善糖尿病癥狀。GK在控制血糖穩(wěn)態(tài)和代 謝中的作用主要表現(xiàn)為：一方面調(diào)節(jié)肝糖代謝，當(dāng)空腹或血糖低時(shí)，GK活性低下，肝糖輸出 增加，以保證重要器官的能量供給；餐后或血糖高時(shí)，GK活性增強(qiáng)，可促進(jìn)肝糖原合成，抑 制肝臟糖異生，以維持血糖穩(wěn)態(tài)。
[0004] 隨著基因組測序計(jì)劃的完成以及新一代深度測序技術(shù)的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中多于95%的轉(zhuǎn)錄序列為非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)。非編碼RNA是一類不 編碼蛋白質(zhì)但具有生物學(xué)調(diào)控功能的RNA分子，它可通過參與mRNA的穩(wěn)定和翻譯水平的 調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、RNA的加工和修飾以及影響染色體的結(jié)構(gòu)等機(jī)制，調(diào)控生物體的基本 生命活動(dòng)，同時(shí)與一些重要疾病的病理生理過程相關(guān)。非編碼RNA包括短非編碼RNA(包 括 siRNA、miRNA、piRNA)和長非編碼 RNA(long non-codingRNA，IncRNA)。長度大于 200 個(gè)堿基（200nt)為長鏈非編碼RNA (IncRNA)。目前長度小于50個(gè)核苷酸的非編碼RNA (如 microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性進(jìn)展，但對具有功能的長非編碼RNA的 研究不多。本項(xiàng)目前期用SOLiD高通量測序并通過生物信息學(xué)預(yù)測和分子生物學(xué)驗(yàn)證確 定大鼠肝臟存在長非編碼長非編碼核糖核酸uc. 48+(http://genome, ucsc. edu/cgi-bin/ hgc ? hgsid = 42796767l_gIIKDUiyguaFXCbRBiffSM7gF0gqn&c = chr2&o = 20462844&t = 20463142&g = ct_Ultra_7128&i =% 28null% 29+uc. 48)，并發(fā)現(xiàn)糖尿病模型大鼠肝臟長 非編碼核糖核酸uc. 48+表達(dá)較對照組明顯增加，提示肝臟的長非編碼核糖核酸uc. 48+與 糖尿病的病理變化有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA的第一個(gè)新 用途，即長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA在制備降低血糖功能的防治糖尿病及并發(fā)疾 病藥物應(yīng)用、及高血糖引發(fā)的其它疾病的藥物應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA的第二個(gè)新 用途，即長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA在制備提高葡萄糖激酶活性、防治其功能異 常介導(dǎo)的糖尿病及并發(fā)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA的第三個(gè)新 用途，即長非編碼核糖核酸uc. 48+在制備糖尿病并發(fā)疾病或長非編碼核糖核酸uc. 48+功 能異常相關(guān)疾病的診斷試劑、探針或診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明通過2型糖尿病大鼠模型，觀察長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA處理 后2型糖尿病大鼠空腹血糖、餐后血糖變化，以及與肝葡萄糖激酶（GK)表達(dá)變化的關(guān)系，為 長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA用于糖尿病的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)幫助。
[0009] 長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA在防治糖尿病及并發(fā)疾病的作用機(jī)理涉及： 提高肝組織葡萄糖激酶的表達(dá)和活性，產(chǎn)生降血糖功能的作用，對糖尿病及其并發(fā)疾病產(chǎn) 生防治作用。
【附圖說明】
[0010] 圖1逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)方法檢測長非編碼核糖核酸UC. 48+小干擾核 糖核酸對2型糖尿病大鼠肝臟葡萄糖激酶（GK)mRNA表達(dá)的影響圖。實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組、 糖尿病模型組、糖尿病模型+長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾處理組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次 取平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖I (a)為RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖I (b)為實(shí) 驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖，其中**P〈〇. 01表示和正常組比較，#P〈〇. 01表示與DM+NS組比較。
[0011] 圖2蛋白印跡方法檢測長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾處理對2型糖尿病大鼠 肝臟葡萄糖激酶（GK)蛋白表達(dá)量的影響圖。實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組、糖尿病模型組、糖尿病 模型+長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾處理組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖2(a)為蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖2(b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀 圖，其中#p〈〇. 05表示和正常組比較，#p〈0. 01表示與DM+NS組比較。
[0012] 圖3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測2型糖尿病人血清中長非編碼核糖核酸 uc. 48+的濃度變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2型糖尿病人血清中長非編碼核糖核酸uc. 48+的濃度 較健康對照組增加。圖3 (a)為RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖3 (b)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析比較柱狀圖， 其中*p〈0. 05,表示與健康對照組比較。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例并對照附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0014] 實(shí)施例1 :
[0015] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于糖尿病并發(fā)疾病治療的口服或注射的長非 編碼核糖核酸uc. 48+小干擾核糖核酸制劑。
[0016] 實(shí)施例2:
[0017] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及葡萄糖激酶（GK)介導(dǎo)疾病治療的口 服或注射的長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾核糖核酸制劑。
[0018] 實(shí)施例3 :
[0019] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及在制備治療糖尿病并發(fā)疾病或長非編 碼核糖核酸uc. 48+功能異常相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物中的應(yīng)用。
[0020] 實(shí)施例4 :
[0021] 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及在制備治療長非編碼核糖核酸uc. 48+ 功能異常相關(guān)疾病的口服或注射的長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾核糖核酸制劑。
[0022] 總之，長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾核糖核酸以口服、注射、含片或其它局部 或全身可用藥劑型藥物進(jìn)行上述疾病防治。
[0023] 為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA對2 型糖尿病模型大鼠血糖的作用，及對肝組織葡萄糖激酶的表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)和相關(guān)結(jié)果來證 明長非編碼核糖核酸uc. 48+小干擾RNA的用途。
[0024] 一、材料和方法。
[0025] 1.動(dòng)物和分組。
[0026] Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體重200g左右，分籠飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)7只，溫度 20-25°C，相對濕度40% -70%，晝夜明暗交替12h/12h，自由飲水，適應(yīng)1周后禁食不禁水 12h剪尾采血測血糖。將大鼠隨機(jī)分成對照組（Con) (10只）和模型組（40只），對照組始 終喂養(yǎng)普通飼料（由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供），模型組喂養(yǎng)高糖高脂飼料（基 礎(chǔ)飼料66. 5%，蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2. 5%，膽酸鈉1 %，加水做成條狀放在恒溫鼓 風(fēng)干燥箱中80°C干烤3小時(shí)）。第5周末（即模型組喂高糖高脂飼料4周后