自體骨髓源性干細(xì)胞的快速輸注的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)主張于2013年1月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)，申請(qǐng)序列號(hào)為61/751846 的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)公開(kāi)的內(nèi)容以引用方式全文明確地并入于此。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種快速即時(shí)檢測(cè)（point-of-care)的方法和具有細(xì)胞群的組合物， 所述快速檢測(cè)方法用于對(duì)個(gè)體抽吸、分離、檢測(cè)和遞送預(yù)設(shè)劑量和粘度的獲取自骨髓的細(xì) 胞群及附帶的因子（accompanying factors);所述包含于組合物中的細(xì)胞群包括骨髓干細(xì) 胞和/或祖細(xì)胞、抗凝劑以及37°C測(cè)量時(shí)小于或等于5.0厘泊（cP)的粘度。
【背景技術(shù)】
[0004] 心血管疾?。–VD)是全球發(fā)病和死亡的首要原因。2008年，估計(jì)有1730萬(wàn)人死 于CVD，占全球死亡總數(shù)的30%。在這些死者中，估計(jì)730萬(wàn)人死于冠心病，620萬(wàn)人死于 腦卒中。更值得注意的是，低收入和中等收入國(guó)家不相稱(chēng)地被影響，推動(dòng)對(duì)代替慢性藥物治 療方案的再生療法的需求，這種再生療法必需以消除對(duì)高成本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)設(shè)施或血管導(dǎo)管實(shí) 驗(yàn)室廣泛多小時(shí)使用的需求的形式提供。超過(guò)80%的CVD死亡發(fā)生在低收入和中等收入國(guó) 家，在男性和女性中幾乎均等地發(fā)生。在CVD的病程中，動(dòng)脈中發(fā)展出斑塊損傷，其導(dǎo)致血 管狹窄，并且在重癥患者中，所述斑塊病變脫落（break open)，在心臟、腦或肢體的重要部 位產(chǎn)生血流阻斷（缺血）。若短期內(nèi)通過(guò)再灌注治療，以及進(jìn)一步在有或沒(méi)有胞外因子的 存在下通過(guò)成體組織源性干細(xì)胞的輸注進(jìn)行治療，這種缺血是可能被逆轉(zhuǎn)的。盡管醫(yī)學(xué)治 療以及血管重建策略已有重大進(jìn)展，但是若在早期不引入生物修復(fù)干預(yù)，患有急性心肌梗 死（AMI)、慢性心力衰竭（CHF)、嚴(yán)重肢體缺血（CLI)和缺血性腦損傷（腦卒中）的特定患 者的預(yù)后仍會(huì)不良。
[0005] 與再灌注一起，輔助干細(xì)胞療法對(duì)缺血性損傷所造成的心臟、腦和肢體受損組織 的修復(fù)和再生已顯示出潛在有效性?？蓮牟煌瑏?lái)源分離出這些干/祖細(xì)胞，其中一個(gè)來(lái) 源是骨髓。自體的，骨髓源性為一種情況，外周血源性為第二種情況，脂肪源性為第三種情 況，這類(lèi)成體干/祖細(xì)胞規(guī)避了與胚胎干細(xì)胞相關(guān)的道德和法律問(wèn)題。此外，它也終止了 疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。自體干細(xì)胞（具體是脂肪或外周血，最具體是骨髓源性細(xì)胞 產(chǎn)品）的再生潛能受所采用的抽吸、處理和遞送技術(shù)的高度影響?？鼓齽┰谠偕?xì)胞治療 的整體功效中起到了非常重要的作用，且長(zhǎng)時(shí)間暴露于抗凝劑中已顯示出對(duì)細(xì)胞的"干性 (sternness) "具有負(fù)面的影響。在抽吸注射器和處理裝置中使用抗凝劑讓骨髓保持在非凝 固態(tài)，使得干/祖細(xì)胞適當(dāng)?shù)胤謱印⒎蛛x及輸注以治療臨床病癥?？鼓齽┮苍诓煌潭壬弦?制微血栓（microthrombae)的形成，若其被注入患者體內(nèi)可能導(dǎo)致不良事件。也能理解的 是在蛋白質(zhì)或細(xì)胞（"生物制劑"）的存在下，任何化學(xué)個(gè)體的加入都可能對(duì)所述生物制劑 的結(jié)構(gòu)或功能具有影響。因而，所用的抗凝劑、所用的濃度以及細(xì)胞暴露于抗凝劑中的時(shí)間 單獨(dú)地、潛在地、累計(jì)地對(duì)干細(xì)胞治療功效和安全性的整體效果起到至關(guān)重要的作用。理想 的干細(xì)胞相容的抗凝劑必須處于最優(yōu)的濃度比率平衡，以在一段限定的時(shí)間內(nèi)維持細(xì)胞治 療濃縮物或輸注物處于抗凝態(tài)，以完成介入步驟，并減少或消除血管內(nèi)血栓的形成同時(shí)最 小化圍手術(shù)期出血和干細(xì)胞調(diào)控（modulation)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 肝素是骨髓抽吸中最常用的抗凝劑。但是已被報(bào)道肝素會(huì)干擾干細(xì)胞和/或祖細(xì) 胞的移動(dòng)和歸巢機(jī)制（homing mechanism)，從而削弱這些細(xì)胞的功能治療能力。此外，肝素 與圍手術(shù)期出血的高發(fā)率有聯(lián)系，這可能與它們不能和連于凝塊上的凝血酶（clot-bound thrombin)結(jié)合相關(guān)。更進(jìn)一步地，在體內(nèi)通過(guò)將肝素與血小板因子-4(PF-4)結(jié)合，所述肝 素可被滅活。對(duì)肝素-PF-4復(fù)合物表達(dá)抗體的某些個(gè)體暴露于肝素時(shí)，會(huì)經(jīng)歷肝素誘導(dǎo)的 血小板減小癥（HIT)。
[0007] 抗凝骨髓抽吸物處于異源混合物（包括造血干細(xì)胞（"HSC"）、間充質(zhì)干細(xì)胞 (皿3〇、內(nèi)皮祖細(xì)胞（1?(："）、0父0?4陽(yáng)性細(xì)胞、白血球（"冊(cè)(："）、紅血球（"1?(："）、血小板 ("PLT"）、含血清蛋白和代謝物的血漿（"PLASMA"）和脂肪（"FAT"））中，且不適用于以 原始抽吸物形式直接遞送到患者的血管系統(tǒng)中。此外，為了可重現(xiàn)的病人到病人的治療功 效以便正確地限定治療細(xì)胞混合物的一致性（constituency)，以及為了制備治療細(xì)胞濃縮 物的安全的劑量特定體積（dose specific volume)，必須在短時(shí)間內(nèi)從無(wú)效的和非預(yù)期的 細(xì)胞與脂肪中純化、分離或捕獲治療有效的細(xì)胞（HSC、MSC、WBC、EPC和CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞）， 以在即時(shí)檢測(cè)中產(chǎn)生濃縮的治療劑量的細(xì)胞及因子。
[0008] 細(xì)胞的純化，具體是包含所需HSC、EPC、MSC和其他干/祖細(xì)胞的WBC的純化，歷史 上通過(guò)如下方法完成：將所述細(xì)胞置于封閉裝置（containment device)中，并在重力下使 用基于化學(xué)密度的方法或基于自動(dòng)的不含化學(xué)品的系統(tǒng)采用標(biāo)準(zhǔn)離心分層。在一段限定的 時(shí)間內(nèi)，源自紅骨髓和間質(zhì)的骨髓細(xì)胞在特定的重力（"g力"）下，將依據(jù)它們各自的密度 分層，從而自下而上在所述封閉裝置中產(chǎn)生細(xì)胞層，其中RBC(最稠密的）在底部，隨后是有 核的RBC和VSEL、WBC、PLT、PLASMA和FAT。兩種方法都簡(jiǎn)單地獲得血沉棕黃層，其典型地 被限定為RBC/成核RBC部分之上和PLT部分之下的細(xì)胞層。
[0009] 理想的細(xì)胞純化流程包含閉合的最小化操控步驟（closed minimally manipulated procedure)，用于從不需要的成熟RBC中快速分層與分離所需的HSC、EPC、 MSC以及其他干/祖細(xì)胞，這些細(xì)胞在本文中也可被稱(chēng)為干細(xì)胞或MNC或祖細(xì)胞或骨髓濃縮 物富集的祖細(xì)胞（BMCePC);并以PLASMA注滿(mǎn)所需細(xì)胞成分至出于安全考慮的合適的體積 和粘度，并通過(guò)干細(xì)胞友好的裝置（如整體交換（over the wire)球囊導(dǎo)管或器官內(nèi)遞送 套管）有效地遞送至血管系統(tǒng)。
[0010] 通過(guò)導(dǎo)管操作遞送干細(xì)胞是向近端受累器官輸注細(xì)胞的理想方法。但是，經(jīng)導(dǎo)管 傳輸?shù)募?xì)胞在若干方面對(duì)所需細(xì)胞可能具有潛在的負(fù)面影響。首先，細(xì)胞承受變化的剪切 應(yīng)力，這取決于它們與內(nèi)腔壁接近度、注射速率、內(nèi)腔半徑及流體的粘度；其次，由于內(nèi)腔是 聚合物基質(zhì)，其可潛在地影響細(xì)胞和細(xì)胞膜，其通過(guò)活化、結(jié)合或脫落而產(chǎn)生的接觸會(huì)是重 要的。
[0011] 經(jīng)導(dǎo)管遞送干細(xì)胞至血管系統(tǒng)期望通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)：在外周血管中引入血管內(nèi) 導(dǎo)管，并通過(guò)充氣血管內(nèi)囊，在一定預(yù)設(shè)時(shí)間內(nèi)減緩或阻止血流，在導(dǎo)管尖的近端或末端的 目標(biāo)器官中誘導(dǎo)暫時(shí)性缺血。這種缺血改善干和祖細(xì)胞到缺血組織的歸巢，并增加細(xì)胞引 發(fā)一個(gè)或多個(gè)過(guò)程的機(jī)會(huì)，所述過(guò)程包括但不限于：組織整合、細(xì)胞融合、細(xì)胞分化和/或 旁分泌因子釋放。通過(guò)對(duì)順應(yīng)性或非順應(yīng)性囊充氣以減少或阻止血流來(lái)最佳誘導(dǎo)缺血，同 時(shí)加倍注意從而最小化任何源自囊增壓的內(nèi)皮壁損傷。
[0012] 因此，需要一種改善的方法和組合物，用于骨髓細(xì)胞的抽吸、處理和遞送，以使骨 髓源性干細(xì)胞為缺血性疾病的血管再生和/或器官修復(fù)提供安全和有效的輔助治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 已開(kāi)發(fā)出快速和有效的方法及完備的即時(shí)檢測(cè)試劑盒，其用于在短于90分鐘的 時(shí)間內(nèi)對(duì)分離自骨髓的自體干細(xì)胞及因子的抽吸、處理和輸注。在一些實(shí)施方案中，用于骨 髓采集和處理的方法包括一定量或濃度的抗凝劑，優(yōu)選是比伐盧定，其最小化凝塊形成的 時(shí)間達(dá)90分鐘，而不影響干細(xì)胞治療的功效。
[0014] 本發(fā)明所描述的一些實(shí)施方案產(chǎn)生了預(yù)期的包括干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的混合物， 所述混合物包含血沉棕黃層干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，如與取自骨髓的普通細(xì)胞群相比，具有 減少或降低量的紅細(xì)胞（RBC)的造血干細(xì)胞（HSC)、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC) 和CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明所描述的一些實(shí)施方案提供了在即時(shí)檢測(cè)環(huán)境中的快速細(xì)胞輸注物分析， 保證了用于細(xì)胞治療的充足而有活力的劑量。
[0016] 本發(fā)明所描述的一些實(shí)施方案，在受控的粘度和流速下通過(guò)手動(dòng)或計(jì)量機(jī)制輸注 細(xì)胞群，所述細(xì)胞群含有一定粘度下的骨髓源性干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，所述粘度在正常人 體溫度下測(cè)量（如：37°C時(shí)粘度為 5. 0cP、4. 5cP、4. 0cP、3. 5cP、3. 0cP、2. 5cP、2. 0cP、l. 5cP 或1.0 cP)，以確保有活力的和有效的細(xì)胞劑量可經(jīng)導(dǎo)管注射被遞送，同時(shí)最小化剪切應(yīng)力。
[0017] 本發(fā)明所描述的一些實(shí)施方案，經(jīng)導(dǎo)管輸注上文所述的細(xì)胞群混合物，所述導(dǎo)管 包括適當(dāng)和安全的囊充氣控制機(jī)制。
[0018] -些實(shí)施方案包含了除氯化鈉緩沖劑外作為唯一添加的化學(xué)品的抗凝劑。在一些 實(shí)施方案中所述抗凝劑是比伐盧定。與許多抗凝劑不同的是，比伐盧定產(chǎn)生很少溶血或不 產(chǎn)生溶血。
[0019] 本發(fā)明的實(shí)施方案也包括一次性離心細(xì)胞分層裝置，其可具有可控的閥門(mén)，能夠 對(duì)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的開(kāi)關(guān)位置做出響應(yīng)或可具有密度功能分離裝置，以可采集位于所述裝置之上 或之下的骨髓源性細(xì)胞群。一些實(shí)施方案包括了任選的裝載固件，用于控制多層區(qū)域特定 細(xì)胞群的問(wèn)詢(xún)（interrogation)和采集，其通過(guò)光源透射值對(duì)預(yù)設(shè)光單元的響應(yīng)不同或密 度等于目標(biāo)細(xì)胞密度對(duì)質(zhì)量比率的等密度分離裝置驅(qū)動(dòng)，上述一些實(shí)施方案還包括用于核 實(shí)特定細(xì)胞群或細(xì)胞劑量和特定群粘度的快速分析儀器，以及血管內(nèi)囊導(dǎo)管，其中對(duì)位于 目標(biāo)器官近端的所述囊在規(guī)定時(shí)限內(nèi)進(jìn)行充氣，阻止80-100%的血流以誘發(fā)缺血。在一些 實(shí)施方案中，所采集的細(xì)胞和因子的受控最低細(xì)胞剪切輸注導(dǎo)致減輕程度的細(xì)胞凋亡或其 他細(xì)胞死亡，所述輸注經(jīng)套管腔，以0. 5mL-2. 5mL每分鐘的速度由裝置進(jìn)行控制或計(jì)量，所 述裝置例如是機(jī)械栗或可解釋為在線(xiàn)式手動(dòng)壓力計(jì)的手動(dòng)控制法。
[0020] 本公開(kāi)通過(guò)引用進(jìn)一步總結(jié)得到下述實(shí)施方案：
[0021] 1. 一種組合物，其包括：
[0022] (a)包含骨髓干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的第一細(xì)胞群，
[0023] (b)抗凝劑，以及
[0024] (c)緩沖水溶液和/或自體血清和/或自體血漿成分，
[0025] 其中所述組合物具有的粘度在37°C測(cè)量時(shí)不大于5. 0厘泊（cP)。
[0026] 2.實(shí)施方案1所述的組合物，其中含有骨髓干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的所述第一細(xì)胞 群是自體的。
[0027] 3.實(shí)施方案2所述的組合物，其中含有骨髓干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的所述第一細(xì)胞 群源自所述患者骨骼中的髓腔。
[0028] 4.實(shí)施方案3所述的組合物，其中所述骨骼是髂嵴、股骨、脛骨、脊柱、胸骨或肋 骨。
[0029] 5.實(shí)施方案3所述的組合物，其中包含骨髓干細(xì)胞的所述第一細(xì)胞群源自髂嵴腔 中的髓腔。
[0030] 6.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抗凝劑選自由香豆素、維生 素 K拮抗劑、間接凝血酶抑制劑、肝素、因子X(jué)a抑制劑、直接凝血酶抑制劑、巴曲酶、血紅素 (hemetin)、純化的植物提取物、EDTA、梓檬酸鹽、草酸鹽和硝基血紅素（nitrophorin)組成 的組。
[0031] 7.實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抗凝劑是直接凝血酶抑制劑。
[0032] 8.實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抗凝劑包含比伐盧定。
[0033] 9.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有l(wèi)mg/mL-50mg/mL的濃 度的儲(chǔ)備溶液。
[0034] 10.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有5mg/mL-35mg/mL的 濃度的儲(chǔ)備溶液提供。
[0035] 11.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有10mg/mL-25mg/mL的 濃度的儲(chǔ)備溶液提供。
[0036] 12.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有18mg/mL-22mg/mL的 濃度的儲(chǔ)備溶液提供。
[0037] 13.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定提供自具有20mg/mL的濃度的儲(chǔ) 備溶液提供。
[0038] 14.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以lmg/mL-3mg/mL的濃度存在于 所述組合物中。
[0039] 15.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以I. 5mg/mL-2. 5mg/mL的濃度存 在于所述組合物中。
[0040] 16.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以I. 8mg/mL-2. 2mg/mL的濃度存 在于所述組合物中。
[0041] 17.實(shí)施方案8所述的組合物，其中所述比伐盧定以2mg/mL的濃度存在于所述組 合物中。
[0042] 18.實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中在37°C測(cè)量的所述粘度是 1.0 cP-5. OcP0
[0043] 19.實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中在37°C測(cè)量的所述粘度為 I. 8cP-3. OcP0
[0044] 20.實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中在37°C測(cè)量的所述粘度為 2. OcP-2. 5cP〇
[0045] 21.實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中在37°C測(cè)量的所述粘度為 3. lcP-5. OcP0
[0046] 22.實(shí)施方案1-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述緩沖水溶液包含離子鹽。
[0047] 23.實(shí)施方案1-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述緩沖水溶液包含氯化鈉。
[0048] 24.實(shí)施方案1-21中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述緩沖水溶液包含氯化鈉，且 所述組合物中所述氯化鈉的量是0. 9%。
[0049] 25.實(shí)施方案1-24中任一項(xiàng)所述的組合物，其中包含骨髓細(xì)胞的所述細(xì)胞群包括 單核細(xì)胞，所述單核細(xì)胞包