軟骨結(jié)合型融合蛋白的制作方法
【專利說明】軟骨結(jié)合型融合蛋白
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月29日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/806, 599的優(yōu)先權(quán)，該美國 臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷（例如韌帶、肌腱以及軟骨的撕裂）引發(fā)關(guān)節(jié)組織內(nèi)的多因子變 性級(jí)聯(lián)，包括抑制組織修復(fù)、上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝、細(xì)胞死亡以及關(guān)節(jié)變性的慢性周 期。雖然關(guān)節(jié)損傷的一些方面可以通過手術(shù)組織移植程序來修復(fù)，但這些方法可能僅部分 地恢復(fù)了關(guān)節(jié)的生物力學(xué)穩(wěn)定性。包括手術(shù)療法和姑息療法在內(nèi)的當(dāng)前的治療方法不足以 阻止關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的永久性改變。這種改變影響了物理力和細(xì)胞或組織力學(xué)變化的效應(yīng)（即力 學(xué)生物學(xué)效應(yīng)），包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變，這促成了關(guān)節(jié)病理生理機(jī)制。不存在保護(hù)關(guān)節(jié) 組織防止由這些力學(xué)生物學(xué)效應(yīng)所引起的改變的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的后果的現(xiàn)有藥物療法。因 此，產(chǎn)生關(guān)節(jié)變性病的風(fēng)險(xiǎn)在對(duì)關(guān)節(jié)造成創(chuàng)傷性損傷之后的數(shù)年內(nèi)顯著增加。
[0004] 根據(jù)⑶C，在2003年，關(guān)節(jié)炎和其它風(fēng)濕性病況花費(fèi)了美國1278億美元（808億美 元是醫(yī)療護(hù)理支出以及470億美元是損失的收入）或1. 2%的國內(nèi)生產(chǎn)總值。由創(chuàng)傷性關(guān) 節(jié)損傷所引起的關(guān)節(jié)變性病占關(guān)節(jié)炎的總負(fù)擔(dān)的超過10%。因此，對(duì)由創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷所 引起的關(guān)節(jié)變性病的有效治療的需要顯著未得到滿足。以下公開內(nèi)容解決了這種需要并且 提供了其它益處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 以提供可接受的和有效的療法的方式將藥物直接遞送到患病或受損傷的關(guān)節(jié)仍 是一項(xiàng)顯著的挑戰(zhàn)，如由近期出版物中的以下語句所說明：
[0006] "關(guān)節(jié)內(nèi)療法是具有挑戰(zhàn)性的，這是因?yàn)樗⑸涞奈镔|(zhì)從關(guān)節(jié)間隙中被快速排出； 這樣的消除對(duì)于小分子和大分子這兩者來說都是如此，所述小分子經(jīng)由滑膜毛細(xì)血管離 開，所述大分子由淋巴系統(tǒng)清除。一般來說，可溶性物質(zhì)具有僅以小時(shí)來度量的關(guān)節(jié)內(nèi)停留 時(shí)間。"
[0007] (Evans 等，Nat. Rev. Rheumatol. 2014 年 1 月；10 (1) : 11-22)
[0008] 對(duì)應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)存在長(zhǎng)期的和沒有得到滿足的需求是由在差不多八年前出版的 另一篇報(bào)道中所突出的相同問題來說明的：
[0009] "在未來的IA[關(guān)節(jié)內(nèi)]治療中應(yīng)當(dāng)作為目標(biāo)的主要改進(jìn)是更長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間， 這是因?yàn)橛捎谂c施用相關(guān)的不適/疼痛以及可能的感染風(fēng)險(xiǎn)而期望限制每年IA注射的次 數(shù)。"
[0010] (Gerwin 等，Adv. Drug Deliv. Rev. 2006 年 5 月 20 日；58 (2) : 226-42)
[0011] 因此，本文提供了可以被直接遞送到患病或受損傷的以提供可接受的和有效的療 法的藥物活性蛋白質(zhì)。這些藥物活性蛋白質(zhì)是融合蛋白，所述融合蛋白包含與生長(zhǎng)因子受 體（例如IGF-I受體）的細(xì)胞外域特異性結(jié)合的第一結(jié)構(gòu)域和與軟骨基質(zhì)組分（例如硫酸 化糖胺聚糖和膠原）特異性結(jié)合的第二結(jié)構(gòu)域；以及包含這些融合蛋白的藥物組合物。這 些融合蛋白和藥物組合物特別可用于治療關(guān)節(jié)變性病，如骨關(guān)節(jié)炎。還提供了使用本文所 公開的融合蛋白和藥物組合物來治療肌肉骨骼疾病的方法。
[0012] 在一個(gè)方面，本公開提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和 第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)構(gòu)域與生長(zhǎng)因子受體的細(xì)胞外域特異性結(jié)合，并且所述 第二結(jié)構(gòu)域與軟骨基質(zhì)組分特異性結(jié)合，并且在所述融合蛋白內(nèi)（即在存在于所述融合蛋 白中時(shí)），每一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域均表現(xiàn)出特異性結(jié)合活性。
[0013] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含單條多肽鏈。在某些實(shí)施方案中，在所述融 合蛋白內(nèi)（即在存在于所述融合蛋白中時(shí)），每一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域均表現(xiàn)出原生結(jié)合活性。
[0014] 在某些實(shí)施方案中，所述第一結(jié)構(gòu)域是IGF-I受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案 中，所述IGF-I受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有包含人類IGF-I的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所 述IGF-I受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。
[0015] 在某些實(shí)施方案中，所述第二結(jié)構(gòu)域是SGAG (硫酸化糖胺聚糖）結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在 某些實(shí)施方案中，所述sGAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有以下各項(xiàng)的sGAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列、或與以下 各項(xiàng)的sGAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或基本上同源的序列：富含脯氨酸/精氨酸末端富含亮氨酸 重復(fù)蛋白(proline-arginine-rich end leucine-rich repeat protein，PRELP)、軟骨粘 合素（CHAD)、抑瘤素 M、膠原 IX、BMP-4、纖維連接蛋白、RAND1、RAND2、RAND3、RAND4、RAND5、 RAND6、AKK15、RLR22、R1Q17、SEK20、ARK24、AKK24、AL1、AL2、AL3、LGT25、P印 184、P印 186、 P印185、P印239、P印246、ATIII、或FibBeta。在某些實(shí)施方案中，所述sGAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域包 含選自由以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列：SEQ ID N0:2-13和54-70(參見表1)。在一個(gè) 具體的實(shí)施方案中，所述sGAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID N0:2。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所 述sGAG結(jié)合結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO:2組成。
[0016] 在某些實(shí)施方案中，所述第二結(jié)構(gòu)域是膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，所述 膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有以下各項(xiàng)的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列、或與以下各項(xiàng)的膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的序列同源或基本上同源的序列：胞外基質(zhì)蛋白、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、PRELP、軟骨粘合素、 纖維調(diào)節(jié)素、核心蛋白聚糖或無孢蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含選自 由以下各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列：SEQ ID NO: 14-16和21-27(參見表2)。
[0017] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含選自SEQ ID N0:17-20、28-53以及71-87 的氨基酸序列（參見表3)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 18中 所示的氨基酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合蛋白由SEQ ID NO: 18中所示的氨 基酸序列組成。
[0018] 在某些實(shí)施方案中，在存在于所述融合蛋白中時(shí)，每一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域均表現(xiàn)出原 生結(jié)合活性。
[0019] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含少于40, 000個(gè)、35, 000個(gè)、30, 000個(gè)、 25, 000 個(gè)、20, 000 個(gè)、15, 000 個(gè)、10, 000 個(gè)、7, 500 個(gè)、5, 000 個(gè)、2, 500 個(gè)、1，000 個(gè)、500 個(gè)、 或250個(gè)氨基酸。
[0020] 在某些實(shí)施方案中，在注射到哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中之后，所述融合蛋 白在關(guān)節(jié)的軟骨組織內(nèi)保留如下的一段時(shí)間，這段時(shí)間是與所述融合蛋白的不同之處僅在 于第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域是不與軟骨基質(zhì)組分特異性結(jié)合的突變結(jié)構(gòu)域的融合突變蛋白保留的 時(shí)間的至少：1. 5倍、2倍、3倍、四倍、五倍、六倍、七倍、Λ倍、九倍、十倍、二十倍、四十倍、 五十倍、六十倍、七十倍、八十倍、九十倍、或一百倍。在某些實(shí)施方案中，所述關(guān)節(jié)是受損 的關(guān)節(jié)或患病的關(guān)節(jié)，并且在軟骨組織中保留的融合蛋白的量是每克組織至少約5pmol、約 lOpmol、約20pmol、或約50pmol。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是大鼠或馬，所述關(guān)節(jié) 是受損的關(guān)節(jié)或患病的關(guān)節(jié)，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天時(shí)， 當(dāng)與已經(jīng)被注射了對(duì)照蛋白的匹配對(duì)照關(guān)節(jié)的以下1)、2)、3)或4)的丟失相比時(shí)，所述關(guān) 節(jié)表現(xiàn)出以下各項(xiàng)的丟失減少：1)來自軟骨組織的sGAG、2)細(xì)胞含量、3)總軟骨組織、或 4)骨質(zhì)量。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是大鼠或馬，所述關(guān)節(jié)是受損的關(guān)節(jié)或患病的 關(guān)節(jié)，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天時(shí)，軟骨組織的特征在于 當(dāng)與已經(jīng)被注射了對(duì)照蛋白的匹配對(duì)照關(guān)節(jié)的軟骨組織中sGAG的產(chǎn)生相比時(shí)，所述軟骨 組織中sGAG的產(chǎn)生增加。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是大鼠或馬，所述關(guān)節(jié)是受損 的關(guān)節(jié)或患病的關(guān)節(jié)，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13天、或14天時(shí)，軟骨組 織的特征在于當(dāng)與已經(jīng)被注射了對(duì)照蛋白的匹配對(duì)照關(guān)節(jié)的軟骨組織中sGAG的水平相比 時(shí)，所述軟骨組織中sGAG的水平升高。
[0021] 在某些實(shí)施方案中，在將所述融合蛋白注射到哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中之 后，所述融合蛋白在所述關(guān)節(jié)的軟骨組織內(nèi)保留至少8天、至少9天或至少10天的時(shí)間。在 某些實(shí)施方案中，所述關(guān)節(jié)是受損的關(guān)節(jié)，并且在軟骨組織中保留的融合蛋白的量是每克 組織至少約5pmol、約lOpmol、約20pmol、或約50pmol。在某些實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物 是大鼠或馬，所述關(guān)節(jié)是患病的關(guān)節(jié)或受損的關(guān)節(jié)，并且在注射后8天、9天、10天、11天、 12天、13天、或14天時(shí)，當(dāng)與已經(jīng)被注射了對(duì)照蛋白的匹配對(duì)照關(guān)節(jié)的軟骨組織中sGAG的 丟失相比時(shí)，所述關(guān)節(jié)表現(xiàn)出來自軟骨組織的sGAG的丟失減少。在某些實(shí)施方案中，所述 哺乳動(dòng)物是大鼠或馬，所述關(guān)節(jié)是受損的關(guān)節(jié)，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、 13天、或14天時(shí)，軟骨組織的特征在于當(dāng)與已經(jīng)被注射了對(duì)照蛋白的匹配對(duì)照關(guān)節(jié)的軟骨 組織中sGAG的產(chǎn)生相比時(shí)，所述軟骨組織中sGAG的產(chǎn)生增加。在某些實(shí)施方案中，所述哺 乳動(dòng)物是大鼠或馬，所述關(guān)節(jié)是受損的關(guān)節(jié)，并且在注射后8天、9天、10天、11天、12天、13 天、或14天時(shí)，軟骨組織的特征在于當(dāng)與已經(jīng)被注射了對(duì)照蛋白的匹配對(duì)照關(guān)節(jié)的軟骨組 織中sGAG的水平相比時(shí)，所述軟骨組織中sGAG的水平升高。
[0022] 在另一個(gè)方面，本公開提供了一種組合物，所述組合物包含本文所公開的一種或 多種融合蛋白和糖皮質(zhì)激素。合適的糖皮質(zhì)激素包括而不限于阿氯米松（alclometasone)、 倍氯米松（beclometasone)、倍他米松（betamethasone)、布地奈德（budesonide)、 氯潑尼松（chloroprednisone)、環(huán)索奈德（ciclesonide)、皮質(zhì)醇（cortisol)、可的 松普林（cortisporin)、可的伐唑（cortivazol)、地夫可特（deflazacort)、地塞米 松（dexamethasone)、氣氫縮松（fludroxycortide)、氣尼縮松（flunisolide)、醋酸 氣輕松（fluocinonide)、氣可龍（fluocortolone)、氣米龍（fluorometholone)、氣 替卡松（fluticasone)、己酸丙酬氛可他酯（hexacetonhydrocortamate)、氛化可的 松（hydrocortisone)、甲潑尼松（meprednisone)、甲潑尼龍（methylprednisolone)、 莫米松（mometasone)、帕拉米松（paramethasone)、潑尼松龍（prednisolone)、潑尼 松（prednisone)、潑尼立定（prednylidene)、孕留二?。╬regnadiene)、孕留三稀 (pregnatriene)、孕留?。╬regnene)、普洛托迪（proctosedyl)、利美索龍（rimexolone)、 四氫皮質(zhì)酮（tetrahydrocorticosterone)、曲安西龍（triamcinolone)和烏倍他索 (ulobetasol)以及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和酯。在某些實(shí)施方案中，所述糖皮質(zhì)激素 以每克組合物1 μ g-l〇〇〇 μ g的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，所述糖皮質(zhì)激素與脂肪酸綴 合并且所述與脂肪酸的綴合任選地是經(jīng)由酯鍵。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酸包含棕櫚 酸。
[0023] 在某些實(shí)施方案中，所述糖皮質(zhì)激素被包含在微粒載體中。在某些實(shí)施方案中，所 述微粒載體是脂質(zhì)體。在某些實(shí)施方案中，所述微粒載體是多層囊泡。在某些實(shí)施方案中， 所述微粒載體包含高熔融溫度脂質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)包含二硬脂?；字?膽堿（DSPC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A（DPPC)或氫化大豆磷脂酰膽堿（HSPC)。在某些實(shí)施 方案中，所述糖皮質(zhì)激素以微粒載體脂質(zhì)的〇. 1摩爾％ -20摩爾％的濃度存在于微粒載體 中。
[0024] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含具有SEQ ID NO: 18中所示的氨基酸序列的融合蛋白和地塞米松21-棕櫚酸酯，其中所述地塞米松21-棕 櫚酸酯被包含在含有HSPC的多層囊泡中。
[0025] 在某些實(shí)施方案中，在將本文所公開的融合蛋白/糖皮質(zhì)激素組合物注射到受損 的關(guān)節(jié)或患病的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中之后，獲得軟骨基質(zhì)合成讀數(shù)或軟骨降解讀數(shù)，并且 所述讀數(shù)相對(duì)于在不含糖皮質(zhì)激素的匹配組合物的匹配注射之后所獲得的對(duì)照讀數(shù)顯示 出改善作用。
[0026] 在另一個(gè)方面，本公開提供了一種治療關(guān)節(jié)損傷或關(guān)節(jié)疾病的方法，所述方法包 括向關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中施用治療有效量的本文所公開的融合蛋白或組合物。在某些實(shí)施 方案中，所述關(guān)節(jié)損傷或關(guān)節(jié)疾病選自骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、軟骨降解、急性炎癥性 關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、藥物毒性相關(guān)的軟骨缺損、或創(chuàng)傷性軟骨損傷。
[0027] 在另一個(gè)方面，本公開提供了一種組合物，所述組合物在生物相容性水凝膠中包 含本文所公開的一種或多種融合蛋白。
[0028] 在某些實(shí)施方案中，所述水凝膠包含透明質(zhì)酸（HA)、HA衍生物、纖維素衍生物、以 及肝素樣結(jié)構(gòu)域聚合物中的一種或多種。
[0029] 在某些實(shí)施方案中，所述水凝膠包含甲基纖維素?？梢岳萌魏畏肿恿康募谆w 維素，例如約5kDa至約500kDa?？梢栽谒z中利用任何量的甲基纖維素。在某些實(shí)施方 案中，甲基纖維素的量是水凝膠的約1重量％至約10重量％。
[0030] 在某些實(shí)施方案中，所述水凝膠包含HA(例如透明質(zhì)酸鈉）。可以利用任何分子量 的HA，例如約IOkDa至約1.8MDa?？梢栽谒z中利用任何量的HA。在某些實(shí)施方案中， HA的量是水凝膠的約1重量％至約10重量％。
[0031] 在某些實(shí)施方案中，所述水凝膠包含肝素樣結(jié)構(gòu)域聚合物，所述肝素樣結(jié)構(gòu)域聚 合物包含硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素、或肝素?？梢栽谒z中利用任何量的肝素樣結(jié)構(gòu)域 聚合物。在某些實(shí)施方案中，肝素樣結(jié)構(gòu)域聚合物的量是水凝膠的約〇. 05重量％至2重 量％。
[0032] 在某些實(shí)施方案中，所述水凝膠在高于一定的溫度（例如高于35°C )時(shí)具有熱固 性。在某些實(shí)施方案中，所述水凝膠在低于一定的溫度（例如低于35°C)時(shí)是流體或具有 剪切致稀性。
[0033] 在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公開的水凝膠約Iyg至約 1000 yg的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白以每克本文所公開的水凝膠約 100 μ g至約10, 000 μ g的濃度存在。
[0034] 在某些實(shí)施方案中，所述水凝膠還包含糖皮質(zhì)激素。合適的糖皮質(zhì)激素包括而不 限于阿氯米松、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯潑尼松、環(huán)索奈德、皮質(zhì)醇、可的松普林、 可的伐唑、地夫可特、地塞米松、氟氫縮松、氟尼縮松、醋酸氟輕松、氟可龍、氟米龍、氟替卡 松、己酸丙酮?dú)淇伤ァ浠傻乃?、甲潑尼松、甲潑尼龍、莫米松、帕拉米松、潑尼松龍、?尼松、潑尼立定、孕留二烯、孕留三烯、孕留烯、普洛托迪、利美索龍、四氫皮質(zhì)酮、曲安西龍 和烏倍他索以及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物和酯。還可以利用修飾的糖皮質(zhì)激素。在某 些實(shí)施方案中，所述糖皮質(zhì)激素與脂肪酸（例如棕櫚酸）經(jīng)由酯鍵綴合。在某些實(shí)施方案 中，所述糖皮質(zhì)激素被包含在微粒載體中，如脂質(zhì)體或多層囊泡。脂質(zhì)體微粒可以包含高熔 融溫度（Tni)脂質(zhì)，例如DSPC (二硬脂酰基磷脂酰膽堿）、DPPC (二棕櫚?；字Ｄ憠A）或 HSPC (氫化大豆磷脂酰膽堿）。在某些實(shí)施方案中，所述糖皮質(zhì)激素被包含在脂質(zhì)體微粒中 并且以所述脂質(zhì)體脂質(zhì)的0. 1摩爾％ -20摩爾％存在。在某些實(shí)施方案中，糖皮質(zhì)激素被包 含在脂質(zhì)體微粒中并且所述脂質(zhì)體脂質(zhì)占所述水凝膠的〇. 01重量％ -10重量％。在某些 實(shí)施方案中，所述糖皮質(zhì)激素以足夠的濃度存在于水凝膠中，所述濃度足以在將所述藥物 組合物（例如水凝膠）注射到關(guān)節(jié)中時(shí)，刺激軟骨基質(zhì)合成或刺激細(xì)胞存活或防止軟骨基 質(zhì)降解或防止細(xì)胞死亡。在某些實(shí)施方案中，所述糖皮質(zhì)激素以每克水凝膠1 μ g-ιοοο μ g 的濃度存在。
[0035] 在某些實(shí)施方案中，在將所述組合物注射到關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中之后，所述關(guān)節(jié) 的軟骨基質(zhì)合成或降解讀數(shù)相對(duì)于在單獨(dú)注射融合蛋白或融合蛋白加上糖皮質(zhì)激素的組 合之后的讀數(shù)顯示出改善作用。
[0036] 在某些實(shí)施方案中，在將所述組合物注射到關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中之后，所述糖皮 質(zhì)激素以至少約8天（例如9天、10天、11天或12天）的半衰期存在于所述關(guān)節(jié)中。
[0037] 在某些實(shí)施方案中，在將所述組合物注射到關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中之后，所述融合 蛋白在所述關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中保留的時(shí)間比在單獨(dú)注射時(shí)融合蛋白或糖皮質(zhì)激素保留 的時(shí)間要長(zhǎng)。
[0038] 在另一個(gè)方面，本公開提供了一種治療肌肉骨骼疾病的方法，所述方法包括向關(guān) 節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)間隙中施用治療有效量的本文所公開的一種或多種融合蛋白。在某些實(shí)施方案 中，所述肌肉骨骼疾病包括骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、損傷后軟骨降解、急性炎癥性關(guān)節(jié) 炎、感染性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、或是藥物毒性的結(jié)果。
【附圖說明】
[0039] 圖1描繪了本文所公開的融合蛋白與（A)硫酸乙酰肝素和（B)硫酸軟骨素結(jié)合的 圖表，這些圖表示出了 GF-Fus3 (SEQ ID: 18)與乙酰肝素和硫酸軟骨素結(jié)合，而GF-FusI (SEQ ID:1)或GF-Fus4(SEQ ID:33)則不與乙酰肝素和硫酸軟骨素結(jié)合。
[0040] 圖2描繪了本文所公開的融合蛋白與膠原結(jié)合的圖表，所述圖表示出了 GF-Fus5(SEQ ID:34)比 GF-Fus6(SEQ ID:35)更大程度地與膠原結(jié)合。
[0041] 圖3描繪了兩個(gè)圖表，這兩個(gè)圖表示出了 GF-Fusl、GF-Fus2(SEQ ID:32)、 GF-Fus3、GF-Fus4、GF-Fus5、GF-Fus6融合蛋白和野生型IGF對(duì)牛軟骨細(xì)胞（A)和BXPC-3 細(xì)胞（B)中AKT磷酸化的刺激，證實(shí)了所有融合蛋白均將pAKT上調(diào)到與由野生型IGF所引 起的上調(diào)相當(dāng)?shù)乃?。?shù)據(jù)是平均值土SEM。
[0042] 圖4描繪了 sGAG丟失隨時(shí)間（天）變化的圖表，該圖表示出了 GF-Fusl、GF-Fus2 和GF-Fus3以及野生型IGF減少了來自牛軟骨外植體的sGAG丟失。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM。
[0043] 圖5描繪了 35S-硫酸鹽向牛軟骨外植體中的摻入的兩個(gè)圖表，這兩個(gè)圖表示出了 相比于疾病對(duì)照，通過連續(xù)添加 GF-Fusl、GF-FuS2、GF-Fus3以及野生型IGF (黑色條柱）獲 得了增加。在從培養(yǎng)基中去除之后4天或8天時(shí)（白色條柱），GF-Fus3刺激了蛋白多糖生 物合成的最大程度的增加。在第8天（圖5A)和第12天（圖5B)結(jié)束的培養(yǎng)的最后48小 時(shí)期間測(cè)量35S-硫酸鹽的摻入。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM。無處理對(duì)照（健康）的35S-硫酸鹽 摻入率在第8天和第12天時(shí)分別是132. 2±3. 6和140. 3±11.0(平均值土SEM)pmol/hr/ μ g DNA0
[0044] 圖6是sGAG丟失％隨時(shí)間（天）變化的圖表，該圖表示出了 GF-Fusl、GF-Fus3、 GF-Fus5以及GF-Fus6當(dāng)在每一次更換培養(yǎng)基時(shí)供給這些融合蛋白時(shí)減少了來自牛軟骨外 植體的sGAG丟失％。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM。
[0045] 圖7是sGAG丟失％隨時(shí)間（天）變化的圖表，該圖表示出了當(dāng)僅在第0天-第4 天向培養(yǎng)基中添加時(shí)，與GF-Fusl相比，GF-Fus3使來自牛軟骨外植體的sGAG丟失％更大 程度地減少。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM。
[0046] 圖8呈現(xiàn)了 35S-硫酸鹽向牛軟骨外植體中的摻入的兩個(gè)圖表，這兩個(gè)圖表示出 了相比于疾病對(duì)照，當(dāng)在每一次更換培養(yǎng)基時(shí)添加時(shí)GF-Fusl、GF-Fus3、GF-Fus5以及 GF-Fus6使這種摻入增加。GF-Fus3在僅在第0天-第4天添加時(shí)刺激了 35S-硫酸鹽摻入 的最大程度的增加。在第8天（圖8A)和第12天（圖8B)結(jié)束的培養(yǎng)的最后48小時(shí)期間 測(cè)量35S-硫酸鹽的摻入。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM。無處理對(duì)照（健康）的35S-硫酸鹽摻入率 在第8天和第12天時(shí)分別是0. 117±0. 0099和0. 083±0. 0047(平均值土SEM)nmol/hr/ μ g DNA0
[0047] 圖9 : (A)是接受GF-Fus3和抗Infl-I (地塞米松）單獨(dú)處理和組合處理的牛外 植體的sGAG丟失％隨時(shí)間（天）變化的圖表并且（B)是所述牛外植體的35S-硫酸鹽摻入 隨時(shí)間（天）變化的圖表。相比于疾病對(duì)照，使用GF-Fus3與抗Infl-2 (地塞米松-21-棕 櫚酸酯）的組合獲得了最大程度的sGAG丟失％減少和35S-硫酸鹽摻入增加。在第8天和 第12天（圖9B)結(jié)束的培養(yǎng)的最后48小時(shí)期間測(cè)量35S-硫酸鹽的摻入。數(shù)據(jù)是平均值 土SEM。無處理對(duì)照（健康）的35S-硫酸鹽摻入率在第8天和第12天時(shí)分別是153. 5±9. 1 和123·2±8·8(平均值±SEM)pmol/hr/μgDNA。
[0048] 圖10呈現(xiàn)了以下的圖表：㈧GF-Fus2從凝膠4中的累積釋放；(B) GF-Fus2從凝膠 3中的累積釋放；(C)GF-Fus2從凝膠4中的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放；(D)GF-Fus2從凝膠3中的 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放；(E)野生型IGF從凝膠4中的累積釋放；(F)野生型IGF從凝膠3中的 累積釋放；(G)野生型IGF從凝膠4中的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放；(H)野生型IGF從凝膠3中的 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的釋放。GF-Fus2和野生型IGF在第0天-第3天從凝膠3和凝膠4這兩者中 以相似的速率釋放，而在第4天之后沒有進(jìn)一步釋放。數(shù)據(jù)是平均值土 SEM。
[0049] 圖11A、B以及C是抗Infl-2 (地塞米松-21-棕櫚酸酯）從本文所公開的使用命 名規(guī)則凝膠X-Y的水凝膠制劑中的累積釋放隨時(shí)間（天）變化的圖表，其中X對(duì)于凝膠1和 凝膠2來說分別是1或2,并且Y是1-5以指示納米粒子類型。抗Inf 1-2的釋放速率是不 同的以使得在第9天時(shí)最快的釋放制劑（凝膠2-3)與最慢的釋放制劑（凝膠1-1和1-3) 之間的累積釋放相差4倍。數(shù)據(jù)是平均值土SEM。
[0050] 圖12呈現(xiàn)了來自以下各項(xiàng)的sGAG丟失％的圖表：㈧人類