一種用于實(shí)時(shí)監(jiān)測兩種藥物釋放的Janus納米粒子及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于實(shí)時(shí)監(jiān)測兩種藥物釋放的Janus納米粒子及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多功能的納米載藥系統(tǒng)由于能夠顯著改善治療的效率而受到越來越廣泛的研究和關(guān)注。被載體運(yùn)輸?shù)讲≡畈课坏乃幬锏寞熜Р粌H取決于其在病灶部位的累積濃度，同時(shí)也受藥物釋放過程的影響。因此，對(duì)于一個(gè)多功能載藥系統(tǒng)而言，除了示蹤藥物的輸運(yùn)過程，發(fā)展合適的方法監(jiān)控藥物的釋放過程也是非常重要的。傳統(tǒng)的方法通常是體外模擬藥物的釋放環(huán)境以了解其釋放過程，但體外模擬環(huán)境與細(xì)胞甚至體內(nèi)環(huán)境仍存在較大的差異。專利CN104004149A公開了一種兩親性聚合物納米粒子通過聚合物側(cè)基上修飾的香豆素和藥物之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)作用監(jiān)控一種藥物的釋放。專利CN103528996A公開了一種納米金棒通過藥物釋放造成金棒表面等離子體共振吸收峰的改變來監(jiān)測一種藥物釋放過程。然而，臨床上很多治療手段(比如腫瘤化療等)通常是兩種藥物同時(shí)使用。體外檢測藥物釋放有很多方法，比如紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、色譜、質(zhì)譜等等，但是這些方法不能或很少適用于細(xì)胞或體內(nèi)檢測，因此亟需發(fā)展能夠用于細(xì)胞及體內(nèi)監(jiān)測多藥物釋放過程的方法，這類方法尚未見報(bào)道。相對(duì)于載體材料的運(yùn)輸過程，實(shí)時(shí)檢測藥物的釋放過程更加困難，因?yàn)檫@對(duì)載體材料提出了更高的要求，即對(duì)于藥物釋放具有敏感的智能性響應(yīng)，并且能夠產(chǎn)生可監(jiān)測的變化信號(hào)；對(duì)于實(shí)時(shí)監(jiān)測兩種以上藥物釋放而言，更是難上加難，即基于上述對(duì)載體的要求外，還需要可檢測的變化信號(hào)之間不會(huì)產(chǎn)生相互干擾。另夕卜，如果使用兩種不同的載體負(fù)載兩種藥物，則不能精確控制到達(dá)病灶部位的藥物比例；而如果在同一載體上負(fù)載兩種藥物，則一方面藥物各自的載藥量不大，另一方面無法實(shí)現(xiàn)兩種藥物的不同響應(yīng)性釋放。Janus粒子是一類兩面具有不同性質(zhì)的不對(duì)稱粒子，它能夠在同種粒子上集成相對(duì)獨(dú)立的兩種結(jié)構(gòu)以及各異的物理化學(xué)性質(zhì)，可以分別負(fù)載不同藥物并且互不影響，非常適合用于結(jié)合兩種方法監(jiān)測兩種不同藥物的釋放。本發(fā)明制備了一種具有Janus結(jié)構(gòu)的納米粒子，粒子的兩面分別負(fù)載不同藥物，并且能夠分別實(shí)時(shí)監(jiān)測這兩種藥物的釋放。這種雙載藥的Janus納米粒子及其釋藥的實(shí)時(shí)監(jiān)控為評(píng)價(jià)基于納米載體的多響應(yīng)多藥物釋放的過程提供了新的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種用于實(shí)時(shí)監(jiān)測兩種藥物釋放的Janus納米粒子及其制備方法，以解決其它材料無法實(shí)現(xiàn)對(duì)于兩種藥物的兩種響應(yīng)性釋放的實(shí)時(shí)監(jiān)控問題。
[0004]本發(fā)明提供的用于實(shí)時(shí)監(jiān)測兩種藥物釋放的Janus納米粒子，其一端是金納米粒子，另一端是實(shí)心二氧化硅或介孔二氧化硅；兩端可分別負(fù)載兩種不同的藥物，并且可對(duì)所負(fù)載藥物的釋放進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。
[0005]本發(fā)明中，所述金納米粒子可以是納米金球、納米金棒、納米金星或納米金殼。
[0006]本發(fā)明中，所述監(jiān)測藥物釋放的方式可以是熒光光譜、拉曼光譜和核磁共振。
[0007]本發(fā)明提供的這種用于實(shí)時(shí)監(jiān)測兩種藥物釋放的Janus納米粒子的制備方法，包含三個(gè)步驟:
Cl)制備負(fù)載第一種藥物的金納米粒子
例如，將金納米粒子溶液與一定濃度的第一種藥物的溶液攪拌反應(yīng)2-24小時(shí)，能夠與金納米粒子鍵連的藥物(比如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤，鹽酸拓?fù)涮婵?、吉西他濱、阿昔洛韋或法倔唑等等)都可以使用此法；
(2)制備由步驟(I)制備的金納米粒子和二氧化娃納米粒子或介孔二氧化娃納米粒子連接的Janus納米粒子；
此步驟可分為兩種方法，根據(jù)具體情況使用:
第一種方法是Pickering乳液法，將二氧化娃納米粒子或介孔二氧化娃納米粒子分散于水和石蠟的混合溶液中，加熱到70攝氏度以上(一般為70攝氏度-80攝氏度)，在均質(zhì)器中以大于15000 rpm (一般為15000 rpm—20000 rpm)的速度均質(zhì)，冷卻后加入巰基娃燒化試劑反應(yīng)，再加入步驟(I)制得的負(fù)載了第一種藥物的金納米粒子反應(yīng)2-24小時(shí)；
第二種方法是原位生成法，將步驟(I)制得的負(fù)載了第一種藥物的金納米粒子離心洗滌后分散至水中，依次加入到含有異丙醇、水、4-巰基苯甲酸的乙醇溶液和聚丙烯酸水溶液，攪拌后，再加入氨水和含TEOS的異丙醇溶液；
(3)制備負(fù)載第二種藥物的Janus納米粒子
例如，將步驟(2)制得的Janus納米粒子以一定的方式負(fù)載第二種藥物，包括直接與第二種藥物攪拌負(fù)載，或者與第二種藥物以相應(yīng)的化學(xué)鍵如酯鍵、酰胺鍵、腙鍵、亞胺鍵或二硫鍵等等連接，以達(dá)到響應(yīng)性釋放的目的。
[0008]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明所述Janus納米粒子的組成材料二氧化硅和金均具有良好的生物相容性，容易制備，便于修飾。本發(fā)明所述Janus納米載藥系統(tǒng)能同時(shí)負(fù)載兩種藥物，可以精確控制兩種藥物的比例，兩種藥物能以不同的響應(yīng)機(jī)理釋放，并且也能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測這兩種藥物的釋放過程。
【附圖說明】
[0009]圖1為Janus介孔二氧化硅/納米金球的透射電子顯微鏡照片。
[0010]圖2為Janus 二氧化硅/納米金球的透射電子顯微鏡照片。
[0011 ] 圖3為阿霉素-香豆素-二氧化硅/金-6巰基嘌呤Janus納米粒子和HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間的激光共聚焦顯微鏡照片，藍(lán)色熒光((a)香豆素)隨著時(shí)間增加而增強(qiáng)，藍(lán)、綠((b)溶酶體)、紅((C)阿霉素)三種熒光可以重疊((d)合并)，表明納米粒子進(jìn)入溶酶體并且藥物在其中釋放。
[0012]圖4為阿霉素-香豆素-二氧化硅/金-6巰基嘌呤Janus載藥系統(tǒng)和HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間的暗場顯微照片，其中，(a)，(b)，(c)分別為O分鐘，15分鐘，30分鐘的顯微照片，(d)為相應(yīng)的拉曼譜圖，6巰基嘌呤的拉曼信號(hào)隨著時(shí)間的增加而減弱表明其釋放過程。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合附圖及實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0014]實(shí)施例1
(1)制備負(fù)載6-巰基嘌呤(6MP)的納米金球
將100 mL 25 nm納米金球溶液加入I mL 0.1 mg/mL 6MP溶液，反應(yīng)6 h ；
(2)制備含有染料香豆素衍生物的介孔二氧化硅納米粒子
將琥珀酰亞胺化的7-羥基香豆素-3-乙酸與氨丙基硅烷化試劑以摩爾比1.2:1在二氯甲烷中反應(yīng)12 h;然后加入等體積乙醇，得到溶液A。0.5 g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和 0.05 g F127 加入 240 mL 水中，升溫到 80°C，加入 1.75 mL 2 mol/L NaOH, 2.5mL正硅酸乙酯(TEOS)和I mL溶液A，反應(yīng)2 h，離心，在4 %的鹽酸-甲醇溶液中回流12h除去CTAB，離心洗滌后真空干燥；
(3)制備Janus納米粒子
將100 mg步驟(2)制備的介孔二氧化硅納米粒子分散于10 mL含I μΜ CTAB的6.7%乙醇溶液中，加熱到70°C，加入0.5 g石錯(cuò)，在均質(zhì)器上以15000 rpm的速度均質(zhì)20 min，在70°C攪拌I h，冷卻到室溫，加入10 mL甲醇和100 μ? 3-巰丙基乙氧基硅烷反應(yīng)I h，離心，洗滌，分散到100 mL含3 μΜ步驟(I)制備的納米金球溶液中，反應(yīng)2 h，離心，洗滌，真空干燥；
(4)制備負(fù)載鹽酸阿霉素(Dox)的Janus納米粒子
將52 mg己二酸二酰肼溶于4 mL DMS0，加入500 μ?含74 μ?異氰酸丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)12 h，80°C減壓蒸餾，固體加2 mL乙醇，得溶液B。40 mg步驟(3)制得的Janus納米粒子分散于16 mL 95 %乙醇溶液，加60 μ?溶液B，調(diào)pH到5，室溫反應(yīng)4 h，調(diào)pH到中性反應(yīng)過夜，離心，乙醇洗滌，干燥，得固體C。35 mg固體C分散于10 mL 0.3 mg/mL Dox甲醇溶液，加入三氟乙酸調(diào)PH到5，室溫反應(yīng)48 h，離心，洗滌，真空干燥。
[0015]實(shí)施例2
Cl)制備負(fù)載6-硫鳥嘌呤(6TG)的納米金球
100 mL40 nm納米金球溶液中加入I mL 0.1 mg/mL 6TG溶液，反應(yīng)6 h ；
(2)制備含有染料cy3的二氧化娃納米粒子
將琥珀酰亞胺化的cy3染料與氨丙基硅烷化試劑以摩爾比1.2:1在二氯甲烷中反應(yīng)12h，加入等體積乙醇得到溶液A ;
(3)制備Janus納米粒子
將27 mL步驟(I)制得的納米金球以2100 g離心力離心20 min，水洗，分散至10 mL水中，逐滴加入到含有38 mL異丙醇、12 mL水、400 yL含5 mM 4-巰基苯甲酸的乙醇溶液、400 yL含0.645 mM聚丙烯酸的水溶液中，攪拌30 min后，加入1.8 mL氨水和12 mL含8.96 mM TEOS和2 mL溶液A的異丙醇溶液，攪拌12 h ;
(4)制備負(fù)載姜黃素(Cur)的Janus納米粒子
將2 mg己二酸二酰肼溶于4 mL DMS0，加入500 μ?含74 PL異氰酸丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)12 h，80°C減壓蒸饋，固體加2 mL乙醇，得溶液B。40 mg步驟(3)制得的Janus納米粒子分散于16 mL 95 %乙醇溶液，加60 μ?溶液B，調(diào)pH到5，室溫反應(yīng)4 h，調(diào)pH到中性反應(yīng)過夜，離心，乙醇洗滌，干燥，得固體C。35 mg固體C分散于20 mL 0.3 mg/mL Cur甲醇溶液，加入三氟乙酸調(diào)pH到5，室溫反應(yīng)48 h，離心，洗滌，真空干燥。
[0016]實(shí)施例3
(O制備負(fù)載鹽酸拓?fù)涮婵?TPT)的納米金殼
將10 mL納米金殼溶液加入I mL 10 mg/mL TPT水溶液，攪拌6 h，離心；
(2)制備摻雜釓的介孔二氧化硅納米粒子
將0.5 g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和0.05 g F127加入240 mL水中，升溫到80°C，加入1.75 mL 2 mol/L NaOH, 2.5 mL TEOS和0.5 mL氨丙基三乙氧基