析。實(shí)驗(yàn)表明，與常氧 培養(yǎng)相比，缺氧刺激24h可使人或大鼠PASMC遷移率增加，如圖6A和圖6B所示；而在缺氧 刺激的同時(shí)，通過mimic過表達(dá)miR-223,結(jié)果表明，與對(duì)照相比，過表達(dá)miR-223能顯著抑 制人或大鼠PASMC缺氧引起的遷移率增加，如圖6A和圖6B所示。
[0079] 應(yīng)力纖維的形成實(shí)驗(yàn)：為探討miR-223抑制PASMC增殖和遷移的機(jī)制，我們使用鬼 筆環(huán)膚對(duì)PASMC的應(yīng)力纖維進(jìn)行染色，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖7所示，缺 氧刺激24h可使人PASMC和大鼠PASMC應(yīng)力纖維增加；而過表達(dá)miR-223可逆轉(zhuǎn)缺氧促進(jìn) 的應(yīng)力纖維增加。
[0080] W上結(jié)果表明，miR-223通過抑制應(yīng)力纖維形成而抑制PASMC的增殖和遷移。
[0081] 實(shí)施例5miR-223模擬物抑制大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展
[0082] 缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的構(gòu)建與治療：為了研究miR-223對(duì)肺動(dòng)脈高壓的治 療作用，32只SD大鼠（雄性，8周齡，0. 22 + 0. 01kg)由廣東動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中屯、提供，將它們隨機(jī) 分成四組：1)常氧對(duì)照組（腳，2)缺氧對(duì)照組（H)，3)缺氧并注射agomircontrol(C)，4)缺 氧并注射miR-223agomi;r(M)。大鼠在缺氧培養(yǎng)箱中缺氧（10% 〇2)處理21天，構(gòu)建了缺氧 性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。在缺氧1周和2周時(shí)，將化學(xué)合成的miR-223agomi;r(M)、agomir control(C)或生理鹽水（N，H)通過尾靜脈注射導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，缺氧3周后，測(cè)量右屯、室收縮 壓和分析右屯、肥厚指數(shù)，并用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠血清中miR-223的表達(dá)情況，Western blot檢測(cè)肺動(dòng)脈化oB表達(dá)水平變化。
[0083] 右屯、室收縮壓（RVS巧測(cè)定：數(shù)據(jù)表明，常氧對(duì)照組（腳飼養(yǎng)的大鼠右屯、室收縮壓 (RVS巧是12mmHg，而缺氧組的右屯、室收縮壓顯著升高，達(dá)到20mm化(P<0. 001)，說明缺氧 引起了肺動(dòng)脈高壓的形成，大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓模型制備成功。缺氧組中的M組（注射 miR-223agomi;r)大鼠右屯、室收縮壓較H組（注射生理鹽水）和C組（注射agomircontrol) 低，尤其較H組顯著降低（從20mmHg下降到17. 5mmHg，P<0. 05)，如圖8A所示，提示miR-223 對(duì)大鼠缺氧性肺動(dòng)脈高壓的形成有較好的抑制作用。
[0084] 右屯、肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]分析：右屯、室（RV)的重量與左屯、室和室間隔（LV+S) 的重量之比[RV/(LV+S)]作為右屯、肥厚指數(shù)的評(píng)估。與常氧組大鼠比較，缺氧組右屯、室肥 厚指數(shù)是常氧組的2倍（P<0. 001)，而缺氧組中的M組（注射miR-223agomir)大鼠右屯、肥 厚比C組（注射agomircontrol)降低 20% (P<0.05)，如圖 8B所示，說明miR-223mimic 可抑制缺氧性肺動(dòng)脈局壓大鼠右屯、肥厚。
[0085] miR-223在缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠血清中的表達(dá)情況：為確定miR-223agomir導(dǎo) 入大鼠體內(nèi)，并穩(wěn)定表達(dá)，我們采集大鼠血清，用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-223在四組大鼠血 清中的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)WmiR-16作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理。研究表明，大鼠血清miR-223 在缺氧組的水平化和C)比常氧組（腳明顯降低，運(yùn)與小鼠肺組織和PASMC缺氧處理后 miR-223表達(dá)下調(diào)的變化趨勢(shì)一致。而M組（注射miR-223agomir)的血清miR-223水平 是C組的2倍，如圖8C所示，說明agomirmiR-223已成功導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，并能穩(wěn)定表達(dá)至 少一周。
[0086] 化oB在缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈中的表達(dá)情況：為探討化oB在缺氧性肺動(dòng) 脈高壓大鼠中的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)分離了缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈，用Westernblot 檢測(cè)化oB蛋白的表達(dá)水平。從圖8D結(jié)果看出，缺氧組化）肺動(dòng)脈中的化oB比常氧組（腳 升高，該結(jié)果與本研究之前的結(jié)果一致。在注射miR-223agomir的M組中，化oB水平比注 射agomircontrol的C組顯著下調(diào)。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，miR-223是通過革己向 化oB影響缺氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。
[0087] miR-223抑制缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈的增厚：為觀察缺氧性肺動(dòng)脈高壓大 鼠肺動(dòng)脈壁增厚情況，本實(shí)驗(yàn)每組隨機(jī)挑選S只大鼠，進(jìn)行肺組織切片和肥染色觀察。從 圖8E看出，缺氧組大鼠肺動(dòng)脈管壁明顯比常氧組（腳變厚，說明缺氧引起肺動(dòng)脈壁增厚而 誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓形成；而注射miR-223agomir的M組大鼠肺動(dòng)脈壁增生程度比注射agomir control的C組顯著降低，說明miR-223能抑制肺動(dòng)脈壁的增厚。
[0088] 綜上結(jié)果，說明miR-223對(duì)缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓有較明顯的抑制效果。
[0089] 應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可 W根據(jù)上述說明加W改進(jìn)或變換，所有運(yùn)些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保 護(hù)范圍。
[0090]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小分子RNA的應(yīng)用，其特征在于，所述小分子RNA為miR-223,將miR-223用作 Rho激酶制劑，用于制備治療由Rho激酶信號(hào)通路異常激活所引起的疾病的藥物；所述小分 子 RNA 的堿基序列為 5' -UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子RNA的應(yīng)用，其特征在于，所述由Rho激酶信號(hào)通路異 常激活所引起的疾病包括心血管疾病、支氣管哮喘、青光眼、勃起功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病 和腫瘤。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子RNA的應(yīng)用，其特征在于，所述由Rho激酶信號(hào)通路異 常激活所引起的疾病為缺氧性肺動(dòng)脈尚壓。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子RNA的應(yīng)用，其特征在于，所述小分子RNA為化學(xué)合成 的小分子RNA。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小分子RNA的應(yīng)用，其特征在于，所述小分子RNA為質(zhì)粒載體 表達(dá)的小分子RNA。6. -種Rho激酶抑制劑，其特征在于，所述Rho激酶抑制劑為小分子RNA，所述小分子 RNA 為 miR-223,其堿基序列為 5' -U⑶CA⑶UU⑶CAAAUACCCCA-3'。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的Rho激酶抑制劑，其特征在于，所述小分子RNA為化學(xué)合成的 小分子RNA。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的Rho激酶抑制劑，其特征在于，所述小分子RNA為質(zhì)粒載體表 達(dá)的小分子RNA。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的Rho激酶抑制劑，其特征在于，質(zhì)粒載體表達(dá)的小分子RNA的 過程包括以下步驟： a、 設(shè)計(jì)引物，其中，上游引物的序列為5' -CACCTCGAGCTCGGGCTTTACCTGCTTATCT-3'和下 游引物的序列為 5' -GAGAATTCTGTAITTCCCTGAGATGCCAC-3' ； b、 以人基因組DNA為模板，通過設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； c、 用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的PCR片段 作為插入片段； d、 用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI對(duì)PLV4/EGFP慢病毒載體進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的 載體片段； e、 利用T4連接酶連接插入片段與載體片段； f、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞STBL3,培養(yǎng)過夜后，挑取生長情況良好的單菌 落在含有載體相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增； g、 提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將所得質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，表達(dá)miR-223。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種小分子RNA的應(yīng)用及Rho激酶抑制劑，所述小分子RNA為miR-223，將miR-223用作Rho激酶制劑，用于制備治療由Rho激酶信號(hào)通路異常激活所引起的疾病的藥物。小分子RNA以Rho激酶信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子RhoB和MLC2為靶點(diǎn)，顯著抑制Rho激酶信號(hào)通路。小分子RNA可作為一種新的Rho激酶抑制劑用于制備治療心血管疾病、支氣管哮喘、青光眼、勃起功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤等藥物。
【IPC分類】C12N15/867, A61K31/7088, A61P11/06, A61P9/00, C12N15/113, A61P27/06, A61P35/00, A61P25/00, A61P15/10, A61P9/12
【公開號(hào)】CN105147714
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510505817
【發(fā)明人】茍德明, 康康, 張小英, 曾艷, 陳繼棟
【申請(qǐng)人】深圳大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年8月17日