包含囊泡的藥物組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 該申請要求享有歐洲申請EP13154463. 7 (于2013年2月7日提交）的權(quán)益，其兩 者的完整內(nèi)容在此為全部目的通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及藥物組合物，其包含動物囊泡（vesicle)和細(xì)菌囊泡，用于制備所述組 合物的方法，和其用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 癌癥是發(fā)病率和死亡率的主要全球原因，其被預(yù)期在接下來的數(shù)十年變得越來 越普遍。對癌癥的常規(guī)治療包括化學(xué)治療藥物、放射治療和介入性手術(shù)?；诎┌Y細(xì)胞 的分子表達(dá)概況，也已經(jīng)對不同的癌癥類型開發(fā)了特異的激素和抗體治療(例如，赫賽汀 (Herceptin)，用于Her2陽性乳腺癌的抗-Her2抗體)。
[0004] 因?yàn)樗鼈兊奶禺愋浴踩院蛯刂茝?fù)發(fā)關(guān)鍵的長期免疫記憶，癌癥疫苗已經(jīng) 作為對用于癌癥的常規(guī)治療的有吸引力的替代物在近期出現(xiàn)（Dougan等人，AnnuRev Immunol. 2009; 27:83-117，PMID: 19007331)。弁妍康（Cervarix)和加德西（Gardasil) 是預(yù)防性疫苗的成功實(shí)例，其顯示了對宮頸癌預(yù)防的功效。運(yùn)些疫苗，基于來自致癌的人乳 頭瘤病毒（HPV)變體的抗原的遞送，激活了強(qiáng)大的抗病毒免疫應(yīng)答，其因此防止了HPV-誘 導(dǎo)的宮頸腫瘤的新生成。
[000引 2010年，食品與藥品管理局（FoodandDrugA血inistration)批準(zhǔn)了用于晚期前 列腺癌治療的疫苗(普羅文奇（Provenge))的使用。運(yùn)是刺激免疫系統(tǒng)對抗自體抗原W促 進(jìn)癌細(xì)胞殺傷的治療疫苗的第一個(gè)實(shí)例。該疫苗是基于使用前列腺特異蛋白質(zhì)（前列腺酸 性憐酸酶-融合蛋白）（其引發(fā)免疫系統(tǒng)W識別并殺死前列腺癌細(xì)胞）致敏（pulsed)的激 活的樹突狀細(xì)胞的使用。然而，對該疫苗最初的熱情由于其中等的功效(存活期增加4. 1個(gè) 月)和過高的成本(~$93, 000/劑量/患者)而迅速減少。然而，普羅文奇代表了癌癥疫苗發(fā) 展的里程碑并且已經(jīng)開啟了個(gè)人化癌癥疫苗治療領(lǐng)域的新途徑。
[0006] 然而，使用不同遞送載體和/或與多種佐劑配制的基于腫瘤相關(guān)抗原（TAA)的遞 送的大多數(shù)疫苗由于四個(gè)主要原因已經(jīng)導(dǎo)致了令人失望的結(jié)果：（〇很多TAA是低免疫原 性的，因?yàn)樗鼈兪沁^表達(dá)的(例如Her2)或攜帶體細(xì)胞突變的(例如RAS，p53)或翻譯修飾 (例如MUC1)的蛋白質(zhì)；（ii) 一些TAA在胎兒發(fā)育期間頻繁地高表達(dá)(例如CEA)但是不在 成人中高表達(dá)；（iii)TAA，特別是胞內(nèi)的那些，具有低抗原性，因?yàn)樗鼈兪堑托实剡f送至 抗原遞呈細(xì)胞(APC)的；（iv)TAA通常在免疫抑制環(huán)境中或在由有缺陷的抗原呈遞過程(例 如缺少M(fèi)HCI)、不存在共刺激分子(例如缺少B7分子)和免疫抑制因子(例如比-10和TFG) 的釋放導(dǎo)致的TAA建立的免疫耐受情況下表達(dá)。
[0007] 對新的免疫調(diào)節(jié)試劑逆轉(zhuǎn)晚期癌癥狀態(tài)通常的免疫耐受性的能力和增加對癌癥 細(xì)胞免疫監(jiān)督的能力進(jìn)行評估。新型抗原遞送系統(tǒng)和佐劑還W增加癌癥疫苗的效能為目標(biāo) 進(jìn)行發(fā)展。運(yùn)些包括樹突狀細(xì)胞活化劑和生長因子、疫苗佐劑、T-細(xì)胞刺激物和生長因子、 經(jīng)遺傳修飾的T細(xì)胞、細(xì)胞因子、中和或抑制抑制性細(xì)胞的試劑。佐劑，包括那些在臨床中 使用的，諸如明抓和MPL(Romanowski等人，Lancet2009Dec12;374(9706):1975-85， PMID: 19962185)，和那些在臨床發(fā)展的后期使用的，意在通過模式識別受體（PRR)諸如化R 祀向先天免疫系統(tǒng)用于激活。
[0008] 盡管在運(yùn)些領(lǐng)域近期有所進(jìn)步，但是來自癌癥疫苗(例如，用于非霍奇金淋己瘤 (non-Hodgkin'Slymphoma)治療的MyVax和化vid)的臨床研究結(jié)果還沒有令人滿意的， 并且在此仍對能夠克服在癌癥患者中建立的耐受性并且在體內(nèi)有效提升T細(xì)胞和B細(xì)胞水 平并且使T-細(xì)胞數(shù)目維持延長的時(shí)期的有效的免疫刺激分子/疫苗遞送平臺有需求。還 可期望增加的免疫應(yīng)答用于治療不同于癌癥的疾病，特別地，其中的患者可W是免疫受損 (immune-compromised)的，例如由于感染、退行性疾病或老齡。
[0009] 大多數(shù)抗原使用激活的T輔助（Th)細(xì)胞主要是Thl和Th2細(xì)胞激活B細(xì)胞。 Thl細(xì)胞分泌IFN-丫，其激活巨隧細(xì)胞并且誘導(dǎo)通過B細(xì)胞的調(diào)理的抗體（opsonizing antibody)的生產(chǎn)。Thl應(yīng)答主要導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(細(xì)胞應(yīng)答)，其針對胞內(nèi)病原體(侵 襲性細(xì)菌、原生動物和病毒)進(jìn)行保護(hù)。Thl應(yīng)答激活細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞（CTL)，其是T細(xì) 胞的亞群，其誘導(dǎo)由病毒和其它胞內(nèi)病原體感染的細(xì)胞的死亡。天然殺傷（NK)細(xì)胞也通過 Thl應(yīng)答激活，運(yùn)些細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞、通過病毒或胞內(nèi)細(xì)菌感染的細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡/殺傷的 誘導(dǎo)中起到主要作用。在另一方面，化2細(xì)胞通常誘導(dǎo)在對抗胞外病原體(寄生蟲、胞外微 生物和毒素）的防御中至關(guān)重要的體液(抗體）應(yīng)答。
[0010] 對疫苗的化應(yīng)答的量級和類型可W極大地調(diào)節(jié)，取決于抗原制劑使用的佐劑。例 如，明抓是在人疫苗接種(包括對抗白喉-破傷風(fēng)-百日咳、人乳頭瘤病毒的疫苗和肝炎疫 苗)中最通常使用的佐劑（MarrackP等人，（2009).化tRevImmunol.9(4):287-93)，其 主要引起強(qiáng)大的Th2應(yīng)答，但是對于對抗需要的Thl-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的病原體是相當(dāng)無效 的?；痚und氏不完全佐劑（IFA)誘導(dǎo)主要偏向于化2的應(yīng)答與一些Thl細(xì)胞應(yīng)答。對于 MF59?，它是細(xì)胞（Thl)和體液（化2)兩者免疫應(yīng)答的有效刺激物（OttG，（1995).化arm Biotechnol6: 277-96)。其它佐劑，基本上模式識別受體（PRR)的配體，通過誘導(dǎo)先天免 疫進(jìn)行作用，主要祀向APC并且因此影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。PRR家族幾乎全部的成員是佐 劑潛在的目標(biāo)。運(yùn)些包括ToU-樣受體（TLR)、N0D-樣受體（化R)、RIG-I-樣受體（化R)和 C-型凝集素受體（CLR)。它們通過設(shè)及不同銜接分子的途徑信號傳遞，導(dǎo)致不同轉(zhuǎn)錄因子 的激活。運(yùn)些轉(zhuǎn)錄因子（NF-kB、IRF3)誘導(dǎo)在免疫應(yīng)答的引發(fā)、擴(kuò)張和極化中起關(guān)鍵作用 的細(xì)胞因子和趨化因子的生產(chǎn)。
[0011] 由于經(jīng)典的佐劑誘導(dǎo)強(qiáng)大的化2應(yīng)答與較少或無Thl應(yīng)答，因此目前的挑戰(zhàn)是 開發(fā)誘導(dǎo)對疫苗，諸如那些對抗癌癥、肝炎、流感、追疾和HIV的疫苗重要的強(qiáng)大Thl偏向 化ias)的佐劑。正在被開發(fā)的新佐劑是PRR的天然配體或合成激動劑，其是單獨(dú)的或與多 種制劑一同。PRR活化作用刺激了促炎性細(xì)胞因子/趨化因子和I類IFN的生產(chǎn)，其增加了 宿主消滅病原體的能力。因此，在疫苗制劑中滲入病原體相關(guān)分子模式（PAMP)可W改善和 促進(jìn)疫苗特異性應(yīng)答的誘導(dǎo)。 陽〇1引發(fā)明公開 本發(fā)明已開發(fā)了動物囊泡-細(xì)菌囊泡復(fù)合體，其可W在藥物組合物，例如疫苗中使用。 特別地，本發(fā)明人已展示當(dāng)外來體皮力物囊泡)和0MV(細(xì)菌囊泡）一同混合(見例如，實(shí)施例 1)時(shí)，外來體-OMV復(fù)合體自發(fā)形成，并且本發(fā)明人假設(shè)形成了穩(wěn)定的融合復(fù)合體。因此本 發(fā)明提供了用于基于動物囊泡和細(xì)菌囊泡的共同遞送的高免疫原性疫苗的開發(fā)的新平臺。 動物囊泡與細(xì)菌囊泡的組合遞送代表了通過利用兩種組分的主要性能引起先天免疫應(yīng)答 的治療性疫苗有前景的策略： 由細(xì)菌囊泡提供的強(qiáng)大佐劑性；和 針對由動物囊泡呈遞的和與祀向疾病相關(guān)的抗原的特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
[001引此外，本發(fā)明提供了囊泡(特別是外來體-0MV復(fù)合體)，其誘導(dǎo)對疫苗諸如那些針 對癌癥、肝炎、流感、追疾和HIV的疫苗重要的強(qiáng)大Thl偏向。
[0014] 本發(fā)明可用于其中抗原組合至患者免疫系統(tǒng)的呈遞可W是有利的任何治療。例 如，動物囊泡可W呈遞任何疾病相關(guān)抗原，諸如用于癌癥治療的一種或多種TAA，用于感染 治療的一種或多種病原體抗原，或與其它疾病相關(guān)的任何其它抗原或抗原的組合，特別是 對于免疫受損的狀況和/或其中需要免疫的強(qiáng)力增強(qiáng)的(例如，在老年人中）。與細(xì)菌囊泡 的細(xì)菌抗原的強(qiáng)大佐劑特性組合，運(yùn)些通過動物囊泡呈遞的疾病相關(guān)抗原可W對疫苗接種 提供有效的方法。
[0015] 因此，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含：（a)動物囊泡和（b)細(xì)菌囊泡。在一些實(shí) 施方案中，動物囊泡和細(xì)菌囊泡是一同處于復(fù)合體中的，例如通過脂雙層的融合或通過表 面分子附著。在一些實(shí)施方案中，動物囊泡包含疾病相關(guān)抗原，諸如一種或多種TAA、一種或 多種病原體相關(guān)抗原或一種或多種退行性病癥相關(guān)抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，動物囊泡 包含TAA。例如，在一些實(shí)施方案中，動物囊泡是腫瘤來源的。在一些實(shí)施方案中，動物囊泡 是腫瘤來源的外來體。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌囊泡是外膜囊泡（0MV)、微泡（MVs[1])或 "天然0MV" ("N0MV")。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含腫瘤來源的外來體和 0MV的藥物組合物。
[0016] 本發(fā)明還提供了用于制備一種或多種復(fù)合體的方法，其中方法包括混合（a)動物 囊泡和（b)細(xì)菌囊泡的步驟。
[0017] 本發(fā)明還提供了包含（a)動物囊泡和（b)細(xì)菌囊泡的復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中， 復(fù)合體是可獲得的或通過本發(fā)明的方法獲得。在一些實(shí)施方案中復(fù)合體是融合復(fù)合體。
[0018] 本發(fā)明還提供了用于制備藥物組合物的方法，其中方法包括混合（a)動物囊泡和 (b)細(xì)菌囊泡的步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物組合物是免疫原性組合物。
[0019] 相似地，本發(fā)明提供了用于制備藥物組合物的方法，其中方法包括混合第一組合 物和第二組合物的步驟，其中第一組合物包含動物囊泡并且第二組合物包含細(xì)菌囊泡?；?合后，方法可W包括允許來自第一和第二組合物的囊泡彼此相互作用的步驟，從而產(chǎn)生本 發(fā)明的藥物組合物。
[0020] 本發(fā)明還提供了用于在藥物中使用的組合物，其中組合物包含（a)動物囊泡和 (b)細(xì)菌囊泡。該組合物可W在例如，治療或預(yù)防癌癥中使用，例如其中動物囊泡包括TAA。
[0021] 本發(fā)明還提供了在哺乳動物中提高免疫應(yīng)答的方法，其包括對哺乳動物施用本發(fā) 明的藥物組合物。該免疫應(yīng)答可W是抗腫瘤應(yīng)答，例如其中動物囊泡包括TAA。
[0022] 本發(fā)明還提供了動物囊泡和細(xì)菌囊泡兩者在藥物生產(chǎn)中的用途，例如，用于在治 療或預(yù)防癌癥中使用。
[0023] 本發(fā)明還提供了用于制備藥物組合物的方法，其包括步驟：（a)從哺乳動物主體 提取腫瘤細(xì)胞；（b)從提取的腫瘤細(xì)胞獲得囊泡；和（c)將獲得的囊泡與細(xì)菌囊泡混合W提 供藥物組合物?？蒞隨后將該組合物施用至在步驟（a)中提取的腫瘤細(xì)胞所來自的哺乳動 物主體。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于制備藥物組合物的方法，其包括步驟：（a)從自哺乳動物主 體獲得的腫瘤細(xì)胞獲得囊泡；和（b)將獲得的囊泡與細(xì)菌囊泡混合W提供藥物組合物?？?W隨后將該組合物施用至在步驟（a)之前已獲得的腫瘤細(xì)胞所來自的哺乳動物主體。 陽〇2引動物囊泡 可用于本發(fā)明的動物囊泡是從動物細(xì)胞釋放的胞外囊泡。動物囊泡由包含生物分子的 脂雙層限制，并且通常具有20至1000nm的直徑。在本領(lǐng)域中已知?jiǎng)游锬遗莸亩喾N類型， 其包括膜顆粒、膜囊泡、微泡、外來體樣囊泡、外來體、核外粒體樣囊泡、核外粒體或外囊泡 (exovesicle)。!!!紅y等人（F1000BiolRep.2011;3:巧）提供了外來體和其它相似分 泌囊泡的一般性綜述。動物囊泡的不同類型基于直徑、亞細(xì)胞來源、它們在薦糖中的密度、 形狀、沉降速率、脂質(zhì)組合物、蛋白質(zhì)標(biāo)記物和分泌模式（即根據(jù)信號(可誘導(dǎo)的）或自發(fā)地 (組成型的)）進(jìn)行區(qū)分。四種常