從腫瘤中產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性t細(xì)胞的富集群的方法
【專利說明】從腫瘤中產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的富集群的方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求2013年3月1日提交的美國臨時專利申請第61/771，247號的權(quán) 益，將其W引用的方式整體并入本文。 陽00引發(fā)明背景
[0004] 在一些癌癥患者中，使用腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的過繼性細(xì)胞療法（ACT)產(chǎn)生了積極 的臨床反應(yīng)。然而，在將ACT成功地用于癌癥或其它疾病的治療中仍然存在一些障礙。例 如，從腫瘤中分離到的T細(xì)胞可能表現(xiàn)不出足夠的腫瘤特異的反應(yīng)性。因此，需要從腫瘤中 獲得腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞群的改進(jìn)方法。 陽00引發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明的實施方案提供了獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述方法 包括：（a)從腫瘤樣本中獲得T細(xì)胞的混合群化ulkpopulation);化）從混合群中特異地 選擇表達(dá)1'加-3、1^\6-3、4-188^及口〇-1中的任何一種或多種的〔08叮細(xì)胞；和似將化） 中選擇的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞分離，W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0007] 本發(fā)明另一實施方案提供了向哺乳動物施用富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的 方法，所述方法包括：(a)從腫瘤樣本中獲得T細(xì)胞的混合群；化）從混合群中特異地選擇 表達(dá)TIM-3、LAG-3、4-lBBW及PD-1中的任何一種或多種的CD8叮細(xì)胞；（C)將化）中選擇 的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞分離，W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群；和（d)向哺乳動物 施用所述富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0008] 本發(fā)明另一實施方案提供了獲得包含富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的藥物組 合物的方法，所述方法包括：(a)從腫瘤樣本中獲得T細(xì)胞的混合群；化）從混合群中特異 地選擇表達(dá)TIM-3、LAG-3、4-lBBW及PD-1中的任何一種或多種的CD8+T細(xì)胞；（C)將化） 中選擇的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞分離，W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群；和（d)將所 述富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群與藥學(xué)上可接受的載體組合，W獲得包含富集腫瘤反應(yīng) 性T細(xì)胞的細(xì)胞群的藥物組合物。
[0009] 本發(fā)明另一實施方案提供了通過下述方法獲得的富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞 群：(a)從腫瘤樣本中獲得T細(xì)胞的混合群；化）從混合群中特異地選擇表達(dá)TIM-3、LAG-3、 4-1BBW及PD-1中的任何一種或多種的CD8+T細(xì)胞；和（C)將化）中選擇的細(xì)胞與未被選 擇的細(xì)胞分離W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群，用于向哺乳動物施用富集腫瘤反應(yīng) 性T細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0010] 本發(fā)明另外的實施方案提供了相關(guān)的細(xì)胞群W及治療或預(yù)防癌癥的方法。
[0011] 附圖中幾個視圖的簡要描述 陽01引圖1A是顯示從新鮮的黑素瘤樣本中分離的CD37CD8+細(xì)胞百分比的圖，所述細(xì)胞 表達(dá)PD-1、TIM-3、LAG-3、4-lBB、0X40、CD25、CD28、CD27 或CD70。每個點代表一個腫瘤。 [001引圖1B是顯示體外擴(kuò)增觸巧14天后，CD8+細(xì)胞數(shù)目的倍數(shù)擴(kuò)增的圖，所述CD8+細(xì) 胞是從新鮮的黑素瘤樣本中（化化#1913)分離，并被分選為表達(dá)CD8、PD-l、LAG-3、TIM-3或 4-1BB，或者不表達(dá)PD-1、LAG-3、TIM-3 或 4-1BB。
[0014]圖2A-沈顯示了從五個不同的黑素瘤樣本（化化#1913 (A)、化化#3550度）、 化化#3289 (C)、化化#2448值）或化化#3713巧)）中的一個分離的CD8+細(xì)胞中干擾素 (IFN) - 丫的分泌（pg/ml)(黑色柱）或者表達(dá)CD3、CD8和4-1BB的效應(yīng)T細(xì)胞燈eff)的 百分?jǐn)?shù)（灰色柱）。分選表達(dá)〔08、？0-1、1^\6-3、1'加-3或4-188，或者不表達(dá)？0-1、1^\6-3、 TIM-3或4-1BB的細(xì)胞，并且將其在體外擴(kuò)增14天。當(dāng)與自體腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)時，對干擾 素（IFN)-丫的分泌W及4-1BB的表達(dá)進(jìn)行分析。
[0015] 圖3A-3C顯示了在標(biāo)明的效應(yīng)細(xì)胞：祀細(xì)胞比率下，效應(yīng)CD8叮細(xì)胞對目標(biāo)腫瘤 細(xì)胞系TC1913(自體的）（A)、TC3289(同種異體的）度）或TC2448(匹配HLA-A0201的） (C)特異性溶解的百分比，所述效應(yīng)CD8+T細(xì)胞是從黑素瘤樣本化化#1913中分離，并被分 選為表達(dá)CD8 (空屯、圓圈）、PD-1 (黑色圓圈）、TIM-3 (黑色菱形）、LAG-3 (黑色S角形）或 4-1BB(黑色正方形），或者不表達(dá)PD-1 (灰色圓圈）、TIM-3 (灰色菱形）、LAG-3 (灰色S角 形）或4-1BB(灰色正方形）。
[0016] 圖3D-3F顯示了在標(biāo)明的效應(yīng)細(xì)胞：祀細(xì)胞比率下，效應(yīng)CD8叮細(xì)胞對目標(biāo)腫瘤細(xì) 胞系TC3713 (自體的）值)、TC3550 (同種異體的）（巧或TC1379 (同種異體的）（巧特異性 溶解的百分比值-F)，所述效應(yīng)CD8+T細(xì)胞是從黑素瘤樣本化化#3713中分離的，并被分選 為表達(dá)CD8 (空屯、圓圈）、PD-1 (黑色圓圈）、TIM-3 (黑色菱形）或4-1BB(黑色正方形），或 者不表達(dá)PD-1 (灰色圓圈）、TIM-3 (灰色菱形）或4-1BB(灰色正方形）。
[0017] 圖4A顯示了從黑素瘤腳化#37蝴中分離的細(xì)胞對自體腫瘤的識別，所述細(xì)胞 被分選為CD8\PD-rPD-1、4-lBB\4-lBB、4-1BB7PD-1、4-lBB7PD-r、4-lBB/PD-r或 4-lBB/PD-1的細(xì)胞，并在體外擴(kuò)增14天。顯示了與自體腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)時，表達(dá)4-lBB的CD3+CD8+細(xì)胞的百分比。
[001引圖4B是顯示從黑素瘤（化化#3612)中分離后，表達(dá)4-1BB(灰白柱）或分泌IFN-丫（黑色柱）的CD3+CD8+細(xì)胞的百分比的圖。細(xì)胞被分選為CD8\PD-r、PD-l、4-1BB7 PD-1、4-1BB7PD-1\4-1BB/PD-r或4-lBB/PD-1細(xì)胞群，在體外被擴(kuò)增14天，并且在與 自體腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)時，顯示了IFN-丫的分泌W及4-1BB的上調(diào)。
[0019] 圖5A-5C顯示了在標(biāo)明的效應(yīng)細(xì)胞與祀細(xì)胞比率下，通過M化釋放分析所測 定的效應(yīng)CD8+細(xì)胞對目標(biāo)腫瘤細(xì)胞系TC3713(自體的）（A)、TC3550(同種異體的） 度）和TC1379(同種異體的）（C)特異性溶解的百分比，所述效應(yīng)CD8+細(xì)胞是從黑素瘤 (化化#3713)中分離的，并被分選為4-1BB7PD-1 (圓圈）、4-lBB7PD-r(正方形）、4-lBB/ PD-r(菱形）或4-1BB/PD-1 (木）細(xì)胞群。
[0020] 圖6為顯示表達(dá)4-1BB(灰白柱）或分泌IFN-丫（黑色柱）的CD8+細(xì)胞的百分比的 圖，所述CD8+細(xì)胞是從胃腸道腫瘤腳l\i#3446b)中分離的，并被分選為CD8\PD-r、PD-l、 TIM-3\TIM-3、4-lBB+或4-1BB-細(xì)胞群，并且培養(yǎng)擴(kuò)增了 21天。顯示了與自體腫瘤細(xì)胞系 共培養(yǎng)時，IFN-丫和4-1BB的上調(diào)。 陽02U 圖7A和7B顯示體外擴(kuò)增14天后，分選的PD-1細(xì)胞（2985TCR克隆型）（A)或分 選的PD-r細(xì)胞（805TCR克隆型）度）獨特的TCRP鏈CDR3區(qū)氨基酸序列的頻率（％ )。 陽0巧圖7C顯示分選的PD-1細(xì)胞（黑色圓圈）或分選的PD-r細(xì)胞（灰色圓圈）的獨 特的TCRP鏈CDR3區(qū)氨基酸序列的頻率（％ )。 陽02引圖8顯示識別自體腫瘤細(xì)胞系特異表達(dá)的突變抗原表位pl4ARF/pl6INK4a(黑色 圓圈）或HLA-All突變（灰色圓圈）的TCRP鏈克隆型在PD-1群或在PD-r群中的頻率，W及具有未知反應(yīng)性的克隆型（空屯、圓圈）的頻率。
[0024] 發(fā)明詳述
[00巧]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從新鮮腫瘤樣本中選擇的還表達(dá)生物標(biāo)志物TIM-3(包含T細(xì)胞Ig-和粘蛋白結(jié)構(gòu)域的分子-3)、LAG-3(淋己細(xì)胞激活基因3 ;CD223)、4-1BB(CD137)和 PD-UCD279)中的任何一種或多種的CD8+細(xì)胞富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞。與不表達(dá)PD-1、 4-1BB、TIM-3W及LAG-3的CD8+細(xì)胞相比，選擇還表達(dá)運些標(biāo)志物中任何一種或多種的 CD8+細(xì)胞有利地富集更多數(shù)量的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞。
[00%] 在運方面，本發(fā)明的實施方案提供了獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群的方 法，所述方法包括：(a)從腫瘤樣本中獲得T細(xì)胞的混合群；化）從混合群中特異地選擇表 達(dá)TIM-3、LAG-3、4-lBBW及PD-1中的任何一種或多種的CD8叮細(xì)胞訊（C)將化）中選擇 的細(xì)胞與未被選擇的細(xì)胞分離，W獲得富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群。該發(fā)明方法有利 地使向患者施用細(xì)胞前，縮短細(xì)胞的體外培養(yǎng)時間成為可能。此外，該發(fā)明方法有利地提供 了不必進(jìn)行自體腫瘤識別篩選就可向患者施用的富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0027] 上述方法可包括通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，從腫瘤樣本中獲得T細(xì)胞混 合群。例如，可通過將腫瘤樣本分離為可W從中選擇特定的細(xì)胞群的細(xì)胞懸液，而從腫瘤樣 本中獲得T細(xì)胞混合群。獲得T細(xì)胞的混合群的合適的方法可W包括，但不限于下述中的 任何一種或多種：將腫瘤機(jī)械分離（例如切碎）、將腫瘤酶性分離（例如消化）W及吸入術(shù) (例如用針）.
[0028] 從腫瘤樣本中獲得的T細(xì)胞混合群可包含任何合適的T細(xì)胞類型。優(yōu)選地，從腫 瘤樣本中獲得的T細(xì)胞混合群包含腫瘤浸潤性淋己細(xì)胞（TILs)。
[0029] 可從任何哺乳動物中獲得腫瘤樣本。除非另有說明，本文使用的術(shù)語"哺乳動物" 指任何哺乳動物，其包括，但不限于：兔形目的哺乳動物，如兔；食肉目的哺乳動物，包括貓 科動物（貓）和犬科動物（狗）；偶蹄目的哺乳動物，包括?？苿游铮ㄅ＃┖拓i科動物（豬）； 或者奇蹄目的哺乳動物，包括馬科動物（馬）。哺乳動物優(yōu)選為非人類的靈長類，例如靈長 目、猿（Ceboids)目或猴（Simoids)目（猴），或者優(yōu)選類人猿亞目（人和類人猿）。在一 些實施方案中，哺乳動物可W是曬齒目的哺乳動物，如小鼠和倉鼠。優(yōu)選地，哺乳動物為非 人類的靈長類或者人類。特別優(yōu)選的哺乳動物是人。
[0030] 方法可W包括從混合群中特異地選擇表達(dá)TIM-3、LAG-3、4-lBB和PD-1中的任何 一種或多種的CD8+T細(xì)胞。在優(yōu)選實施方案中，該方法包括選擇還表達(dá)CD3的細(xì)胞。該方 法可W包括W任何合適的方式特異地選擇細(xì)胞。優(yōu)選地，利用流式細(xì)胞術(shù)來進(jìn)行選擇?？?使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來實施流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)可W使用任何合適的抗 體和染色劑。例如，可分別使用抗CD3、抗CD8、抗TIM-3、抗LAG-3、抗4-1BB或抗PD-1的抗 體來特異地選擇CD3、CD8、TIM-3、LAG-3、4-lBB或PD-1。優(yōu)選地，選擇抗體，W使其特異地 識別被選擇的特定生物標(biāo)志物并與之結(jié)合?？蓪⒁环N或多種抗體與珠（（如磁珠）或者巧 光染料結(jié)合。優(yōu)選地，流式細(xì)胞術(shù)為巧光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)。
[0031] 在本發(fā)明的實施方案中，特異地選擇可W包括特異地選擇對于表達(dá)TIM-3、LAG-3、 4-lBB或PD-1中的任何一種、表達(dá)TIM-3、LAG-3、4-lBB和PD-1中的兩種或S種的任何組 合或者表達(dá)TIM-3、LAG-3、4-lBBW及PD-1全部四種為陽性