復(fù)合物的制作方法
【專利說(shuō)明】復(fù)合物
[0001] 本發(fā)明設(shè)及血管性血友病因子或其變體（vw巧與因子VIII或其變體（因子VIII) 的共價(jià)復(fù)合物，其中所述復(fù)合物經(jīng)修飾而具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及生產(chǎn) 所述復(fù)合物的方法，W及該復(fù)合物用于治療或預(yù)防出血事件的治療性或預(yù)防性用途。
[0002] 血液凝集因子缺乏可引起多種出血障礙。最常見(jiàn)的障礙包括A型和B型血友病， 其分別由血液凝集因子VIII和因子IX的缺乏造成。血管性血友病則是另一種已知的出血 障礙。
[0003] 在血漿中，因子VIII(FVIII)大多W與血管性血友病因子的W非共價(jià)復(fù)合物的形 式存在。原膚切割后形成的成熟FVIII為由多達(dá)2332個(gè)氨基酸構(gòu)成的多膚，其由若干結(jié)構(gòu) 域組成，如圖1中所示。FVIII在凝血中的功能為加速因子IXa依賴的X因子向Xa因子的 轉(zhuǎn)化。由于FVIII和血管性血友病因子形成復(fù)合物，所W長(zhǎng)期W來(lái)人們認(rèn)為FVIII和血管 性血友病因子的功能是同一分子的兩種功能。到了 70年代才清楚FVIII和血管性血友病 因子是分開(kāi)的分子，只是在生理?xiàng)l件下形成復(fù)合物。80年代，人們確定了FVHI和血管性血 友病因子的解離常數(shù)為約0. 2nmol/L化巧te等人，BiochemJ1989, 257:679-683)，并確定 了兩個(gè)分子的DNA序列。
[0004] 典型血友病，或稱為A型血友病是一種遺傳性出血障礙。其由X染色體連鎖的血液 凝集因子FVHI缺乏導(dǎo)致，幾乎只在男性中發(fā)生，幾率為每10, 000人中1-2人。該X染色體 缺陷是由自身不是血友病患者的女性攜帶者遞送下來(lái)的。A型血友病臨床表現(xiàn)為增加的出 血傾向。在引入FVIII濃縮物進(jìn)行治療前，患有嚴(yán)重血友病的患者平均壽命不到20歲。使 用來(lái)自血漿的FVIII濃縮物顯著改善了A型血友病患者的狀況，極大地增加了平均平均壽 命，使其中大多數(shù)和患者有可能過(guò)上差不多正常的生活。然而，源于血漿的濃縮物及其用途 存在特定問(wèn)題，其中最嚴(yán)重的問(wèn)題為病毒傳播，如引起乙型肝炎、非甲非乙型肝炎W及HIV 的病毒。然而，近年開(kāi)發(fā)了不同的病毒滅活方法及新型高度純化的FVIII濃縮物為血漿來(lái) 源的FVIII建立了非常高的安全標(biāo)準(zhǔn)。
[0005] 接受預(yù)防性FVIII治療的嚴(yán)重A型血友病患者需要每周靜脈（i.V.)施用約S次， 運(yùn)是因?yàn)镕VIII的血漿半衰期只有約12小時(shí)。每次i.v.施用是繁瑣的，伴隨著疼痛，并具 有感染的風(fēng)險(xiǎn)，特別是當(dāng)由患者自身在家中進(jìn)行或由被診斷患有A型血友病的患兒父母進(jìn) 行時(shí)。
[0006] 因此，非常需要?jiǎng)?chuàng)造一種具有增加的功能半衰期的FVIII，使得能夠制造更低頻率 施用的含F(xiàn)VIII的藥學(xué)組合物。
[0007] 已經(jīng)做出一些嘗試來(lái)延長(zhǎng)FVIII的功能半衰期，如通過(guò)減少其與細(xì)胞受體的相互 作用（W0 03/093313A2、W0 02/060951A2)，通過(guò)將聚合物與FVIII共價(jià)連接（W0 94/15625、 W0 97/11957和US4970300)，通過(guò)將FVIII膠囊化（W0 99/55306)，通過(guò)引入新型金屬 結(jié)合位點(diǎn)（W0 97/03193)，通過(guò)用膚鍵（W0 97/40145 和W0 03/087355)或二硫鍵（W0 02/103024A2)將A2結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接至A3結(jié)構(gòu)域，或通過(guò)引入防止凝血酶活化后在A1和A2 結(jié)構(gòu)域間進(jìn)行切割從而保持A1結(jié)構(gòu)域與A2結(jié)構(gòu)域間的共價(jià)連接的突變（W02006/108590)。
[0008] 另一種增強(qiáng)FVIII或血管性血友病因子的功能半衰期的方法是將FVIII進(jìn)行陽(yáng)G 化（wo2007/126808、wo2006/053299、wo2004/075923)或?qū)⒀苄匝巡∫蜃舆M(jìn)行陽(yáng)G化（WO 2006/071801)，其中的想法是PEG化的血管性血友病因子具有增加的半衰期，也會(huì) 間接地增強(qiáng)血漿中存在的FVIII的半衰期。此外，還有人描述了FVIII與半衰期增強(qiáng)多膚 如白蛋白或免疫球蛋白化的恒定區(qū)的融合蛋白（W0 2004/101740、W02008/077616和W0 2009/156137)。
[0009] 血管性血友病因子在不同形式的血管性血友病（VWD)中有缺失、功能缺陷或量減 少的情況，其是一種多聚的粘性糖蛋白，存在于哺乳動(dòng)物的血漿中，其具有多重生理學(xué)功 能。在初期止血（primaryhemostasis)過(guò)程中，血管性血友病因子在血小板表面上的特 定受體與細(xì)胞外基質(zhì)組分如膠原蛋白之間扮演"協(xié)調(diào)者"的作用。此外，血管性血友病因子 是促凝血FVIII的攜帶者，并穩(wěn)定該蛋白質(zhì)。血管性血友病因子在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中 合成為2813個(gè)氨基酸的前體分子。野生型VWF的氨基酸序列與cDNA序列公開(kāi)于Collins 等人1987,Proc化tl.Acad.Sci.USA84:4393 - 4397。所述前體多膚，前體血管性血友病因 子原由22殘基的信號(hào)膚、741殘基的原膚W及存在于成熟的血漿血管性血友病因子中的 2050殘基的多膚構(gòu)成（Fischer等人，陽(yáng)BSLett. 351:345-348, 1994)，也參見(jiàn)圖2中血管 性血友病因子原及成熟血管性血友病因子單體單元。當(dāng)信號(hào)膚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中切割時(shí)，兩個(gè)單 體血管性血友病因子之間形成C末端的二硫橋。在其通過(guò)分泌途徑的進(jìn)一步運(yùn)輸過(guò)程中， 加上12個(gè)N-連接和10個(gè)0-連接的碳水化合物側(cè)鏈。更重要地，血管性血友病因子二聚 體經(jīng)N-末端的二硫橋多聚化，而741個(gè)氨基酸長(zhǎng)的原膚在晚期高爾基體中被PACE/弗林蛋 白酶所切割。原膚及血管性血友病因子的高分子量多聚體（VWF-HMWM)儲(chǔ)存于內(nèi)皮細(xì)胞的 Weibel-Pallade小體中或血小板的a-粒細(xì)胞中。
[0010] 一旦分泌入血漿中，蛋白酶ADAMTS13會(huì)在血管性血友病因子的A2結(jié)構(gòu)域內(nèi)部切 割超大的血管性血友病因子多聚體。血漿血管性血友病因子由全范圍的多聚體組成，從近 似500kDa的單個(gè)二聚體到分子量超過(guò)10,OOOkDa的由高達(dá)或超過(guò)20個(gè)二聚體構(gòu)成的多聚 體。VWF-HMWM具有最強(qiáng)的止血活性，可通過(guò)瑞斯托霉素輔助因子活性測(cè)定（VWF:RCo)而測(cè) 量。VWF:RCo/血管性血友病因子抗原的比率越高，高分子量多聚體的相對(duì)量則越高。
[0011] 血管性血友病因子缺陷是血管性血友?。╒WD)的起因，該病的特征為或多或少都 有顯著的出血表型。3型VWD是最嚴(yán)重的形式，其中血管性血友病因子基本上完全缺失，1 型VWD設(shè)及血管性血友病因子的水平減少，其表型可W非常溫和。2型VWD與血管性血友 病因子的性質(zhì)缺陷有關(guān)，可與3型VWD-樣嚴(yán)重。2型VWD有很多子形式，其中一些與高分 子量多聚體的缺失或減少有關(guān)。2A型VWD的特征為中間體和大的多聚體同時(shí)缺失，并因此 特征在于性質(zhì)缺陷的VWF，其與血小板糖蛋白1受體的結(jié)合能力下降。2B型VWD的特征在 于最高分子量多聚體的缺失。性質(zhì)缺陷的VWF結(jié)合血小板膜上糖蛋白1受體的能力有異常 增強(qiáng)，導(dǎo)致其自發(fā)結(jié)合于血小板W及隨后結(jié)合的血小板和大的血管性血友病因子多聚體的 清除。2M型VWD也是一種血管性血友病因子的性質(zhì)缺陷，其特征為結(jié)合血小板膜上糖蛋白 1受體的能力下降，但具有正常的多聚體分布，如血管性血友病因子抗原水平正常。2N型 VWD(Normandy)在血管性血友病因子中有性質(zhì)缺陷，其中血管性血友病因子結(jié)合凝集因子 FVHI缺乏。盡管血管性血友病因子和血管性血友病因子多聚體的量正常，但患者顯示出下 降的FVIII水平，運(yùn)產(chǎn)生與A型血友病類似的表型。
[0012] VWD是人類最常見(jiàn)的遺傳性出血障礙，治療可W根據(jù)VWD的類型通過(guò)使用1-脫 氨-8-D-精氨酸-加壓素（l-Desamin〇-8-D-Arginin-Vasopressin，DDAVP)的療法進(jìn)行治 療，從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存庫(kù)釋放血管性血友病因子，或通過(guò)用血漿或重組來(lái)源的含血管性血友病 因子的濃縮物進(jìn)行替代治療。血管性血友病因子可由人血漿制備，如EP0503991中描述的 實(shí)例。邸0784632描述了一種分離血管性血友病因子的方法。
[0013] 在血漿中，F(xiàn)VIII與血管性血友病因子W高親和力結(jié)合，其防止前者被成熟前 代謝，因而除了在初期止血（primaryhemostasis)中的作用之外，還在調(diào)控FVIII的 血漿水平中起至關(guān)重要的作用。因此，血管性血友病因子還是對(duì)繼發(fā)止血（secondary hemostasis)的控制中的中屯、要素。血漿中結(jié)合于血管性血友病因子的未活化FVIII的半 衰期為約12小時(shí)。3型VWD中幾乎沒(méi)有或很少存在血管性血友病因子，F(xiàn)VIII的半衰期只 有約2小時(shí)，導(dǎo)致運(yùn)些患者中由于FVIII濃度下降而產(chǎn)生輕度到中度A型血友病的癥狀。
[0014] 血管性血友病因子對(duì)FVIII的穩(wěn)定效應(yīng)已被用于幫助在CH0細(xì)胞中重組表達(dá) FVIII(Kaufman等人，1989,MolCellBiol)。近來(lái)其他使用血管性血友病因子來(lái)穩(wěn)定FVIII 的嘗試已經(jīng)公開(kāi)于幾個(gè)近期的專利申請(qǐng)中（W02011060242、W02013083858、W02013106787、 W02014011819)〇
[0015] 仍然有需要獲得增加FVIII半衰期的其他更好的方法。本申請(qǐng)的發(fā)明者發(fā)現(xiàn) FVIII分子與半衰期延長(zhǎng)的血管性血友病因子分子的共價(jià)連接會(huì)使FVIII部分的半衰期也 延長(zhǎng)到與未融合的半衰期延長(zhǎng)的血管性血友病因子分子類似。使用所述方法，使大鼠PK模 型中FVIII的半衰期是游離FVIII的約3倍。本發(fā)明提供了血管性血友病因子或其變體 (VW巧與因子VIII的共價(jià)復(fù)合物，具體而言使用了方法W增加復(fù)合物中VWF組分的半衰期， 運(yùn)樣使能夠提供具有延長(zhǎng)半衰期的穩(wěn)定復(fù)合物，所述復(fù)合物在治療和預(yù)防出血障礙上有優(yōu) 勢(shì)。
[001引發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明的第一個(gè)方面設(shè)及包含血管性血友病因子或其變體（VW巧與因子 VIII(FVIII)或其變體（因子VIII)的共價(jià)復(fù)合物，其中所述復(fù)合物經(jīng)修飾從而其具有延長(zhǎng) 的體內(nèi)半衰期。優(yōu)選地，其經(jīng)修飾而包含半衰期延長(zhǎng)部分。VWF和因子VIII形成共價(jià)復(fù)合 物；半衰期延長(zhǎng)的部分連接至該復(fù)合物任何部位，優(yōu)選地連接至VWF部分。優(yōu)選地，VWF和 因子VIII通過(guò)直接的共價(jià)鍵相連，例如通過(guò)作為VWF-部分的半脫氨酸與作為FVIII-部 分的半脫氨酸形成的二硫橋連接，或通過(guò)將VWF可選地經(jīng)由膚連接子與VIII融合，前提條 件是所述共價(jià)復(fù)合物不是Fc融合蛋白，其中Fc的一條鏈融合于VWF而另一條Fc鏈融合于 FVIII或其變體。優(yōu)選地，所述共價(jià)連接不是由所述半衰期延長(zhǎng)部分提供。
[0018] 在第一個(gè)實(shí)施方式中，因子VIII經(jīng)修飾而與VWF形成二硫橋（條件是該二硫橋不 是在Fc分子中分別融合于VWF和因子VIII的兩條鏈之間）。優(yōu)選地，通過(guò)用半脫氨酸殘 基置換天然存在的氨基酸或插入半脫氨酸殘基W修飾因子VIII，所述半脫氨酸殘基與VWF 中半脫氨酸殘基形成二硫橋。優(yōu)選地，因子VIII中被置換的天然存在的氨基酸選自a3結(jié) 構(gòu)域中的氨基酸，或半脫氨酸殘基是插入曰3結(jié)構(gòu)域（SEQIDNo. 6中殘基1649-1689)中 的。更優(yōu)選地，所述天然存在的氨基酸為酸性殘基，優(yōu)選地為保守的酸性殘基，或參與血友 病表型的殘基，或FVIII曰3結(jié)構(gòu)域中可能硫化的Tyr殘基。更優(yōu)選地，因子VIII中被置換 的天然存在的氨基酸位于因子VIIIa3結(jié)構(gòu)域的氨基酸1653至1660中、或氨基酸1667至 1674中、或氨基酸1675至1688中，或者將半脫氨酸殘基引入因子VIIIa3結(jié)構(gòu)域的氨基 酸1653至1660中、或氨基酸1667至1674中、或氨基酸1675至1688中。甚至更優(yōu)選地， 因子VIII曰3結(jié)構(gòu)域中被半脫氨酸置換的天然存在的氨基酸選自SEQIDNO:6中的T1653、 L1655、D1658、E1660、S1669、V1670、N1672、K1673、K1674、E1675、D1676 和 / 或N1685,或 因子VIII的遺傳工程化形式中的等同位置。最優(yōu)選地，a3結(jié)構(gòu)域中被半脫氨酸置換的天 然存在的氨基酸選自沈QIDNO:6 中的T1654、Q1656、F1677、D1678、I1679、Y1680、D1681、 E1682、D1683、E1684、Q1686、S1687和/或P1688,或因子VIII的遺傳工程化形式中的等同 位置。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，將半脫氨酸殘基插入因子VIII的C末端結(jié)構(gòu)域，或被半脫 氨酸置換的天然存在的氨基酸位于因子VIII的C末端結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地所述殘基選自SEQID N0:6 中的I2098、S2119、N2129、R2150、P2153、W2229、Q2246,或因子VIII的遺傳工程化形 式中的等同位置。
[0020] 在本發(fā)明第一方面的進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式中，還通過(guò)用半脫氨酸置換天然存在 的氨基酸或插入半脫氨酸殘基而修飾VWF，所述半脫氨酸殘基與引入因子VIII的半脫氨酸 殘基形成二硫橋。優(yōu)選地，將半脫氨酸殘基插入D'或D3結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖2)，或者VWF中用 半脫氨酸殘基置換的天然存在的氨基酸為D'或D3結(jié)構(gòu)域中的殘基或者為D'或D3結(jié)構(gòu)域 中堿性或高度保守的殘基或者為N型VWD中設(shè)及的殘基或者為暴露于VWF分子表面的氨基 酸。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將半脫氨酸殘基插入TIL'結(jié)構(gòu)域、E'結(jié)構(gòu)域、VWD3 結(jié)構(gòu)域、C8-3結(jié)構(gòu)域、TIL-3結(jié)構(gòu)域或E-3結(jié)構(gòu)域，或者VWF中被半脫氨酸殘基置換的天然 存在的氨基酸為T(mén)IL'結(jié)構(gòu)域、E'結(jié)構(gòu)域、VWD3結(jié)構(gòu)域、C8-3結(jié)構(gòu)域、TIL-3結(jié)構(gòu)域或E-3 結(jié)構(gòu)域中的殘基（W上結(jié)構(gòu)域皆由Zhou等人（2012)Bloodl20(2)，449-458確定）。例如， VWF中的天然存在的氨基酸選自K773、G785、E787、A/T789、K790、T791、Q793、N794、M800、 R820、R826、F830、冊(cè)31、K834、E835、P838、K843、R852、R854、K855、W856、冊(cè)61、冊(cè)74、K882、 1884、R906、腳 12、冊(cè) 16、腳20、腳23、R924、腳40、R945、腳48、冊(cè)52、R960、腳68、R976、冊(cè)77、 K985、腳91、K1026、R1035、K1036、K1052、Q1053、K1073 或H1074。優(yōu)選地，VWF中的所述天 然存在的氨基酸選自沈QIDN0:2 中的Y795、R816、冊(cè) 17、P828、D853、D879、腳22、D951、 E1078、E1161和/或R1204,或VWF的工程化形式中的等同位置。更優(yōu)選地，VWF中的天然 存在的氨基酸選自沈QIDN0:2 中的R768、R782、冊(cè) 17、D853、E933、1984、E1015、D1076、 E1078、P1079、K1116和/或N1134,或例如VWF的工程化形式中的等同位置。
[0021] 更優(yōu)選地，引入了VWF和FVIII中天然存在的氨基酸殘基的置換的一種 或多種W下組合：A/T789C:D1658C、M800C:D1658C、P828C:D1658C、F830C:D1658C、 P838C:D1658C、D853C:D1658C、R924C:D1658C、E1078C:D1658C、F830C:D1663C、 P838C:D1663C、D853C:D1663C、E1078C:D1663C、E1078C:Y1664C、P838C:D1665C、 R816C:D1666C、F830C:D1666C、E835C:D1666C、T791C:E1671C、F830C:E1671C、 E835C:E1671C、D879C:E1671C、A/T789C:E1675C、T791C:E1675C、N794C:E1675C、 P828C:E1675C、F830C:E1675C、E835C:E1675C、P838C:E1675C、D879CE1675C、R924C:E1675C、 E1078C:E1675C、A/T789C:D1676C、T791C:D1676C、N794C:D1676C、F830C:D1676C、 E835C:D1676C、A/T789C:D1678C、F830C:D1678C、E835C:D1678C、A/T789C:I1679C、 M800C:I1679C、F830C:I1679C、E835C:I1679C、R854C:I1679C、D879C:I1679C、A/ T789C:Y1680C、T791C:Y1680C、Y795C:Y1680C、M800C:Y1680C、R816C:Y1680C、 F830C:Y1680C、E835C:Y1680C、R854C:Y1680C、D879C:Y1680C、A/T789C:E1682C、Y795C:E1682C、R816C:E1682C、P828C:E1682C、E835C:E1682C、P838C:E1682C、 R854C:E1682C、D879C:E1682C、Q1053C:E1682C。
[0022] 甚至更優(yōu)選地，引入了VWF和FVIII中天然存在的氨基酸殘基的置換的一種或多 種W下組合：F1677C:R768C、I1679C:R768C、Y1680C:R768C、N1685C:R768C、T1654C:R782C、 E1675C:R782C、N1685C:R782C、Q1686C:Y795C、S1687C:Y795C、P1688C:Y795C、 P1688C:Y795C、E1675C:H816C、D1676C:R816C、Y1680C:R816C、E1682C:R816C、 P1688C:R816C、Y1680C:H817C、N1685C:H817C、Q1686C:H817C、S1687C:H817C、 I1679C:P828C、Y1680C:D853C、N1685C:D853C、T1654C:D879C、P1688C:E933C、P1688:T951C、 T1653C:L984C、T1654C:L984C、L1655C:L984C、S1669C:L984C、K1673C:L984C、 D1683C:L984C、T1653C:E1015C、L1655C:E1015C、S1669C:E1015C、V1670C:E1015C、 N1672C:E1015C、K1673C:E1015C、D1678C:E1015C、I1679C:E1015C、E1684C:E1015C、 S1687C:E1015C、F1677C:V1027C、I1679C:V1027C、P1688C:V1027C、S1657C:D1076C、 K1673C:D1076C、D1676C:D1076C、F1677C:D1076C、I1679C:D1076C、E1682C:D1076C、 D1683C:D1076C、Q1686C:D1076C、D1676C:E1078C、I1679C:E1078C、Y1680C:E1078C、 T1653C:P1079C、L1655C:P1079C、S1657C:P1079C、D1658C:P1079C、E1682C:P1079C、 V1670C:K1116C、K1673C:K1116C、D1676C:K1116C、D1678C:K1116C、D1681C:K1116C、 Q1686C:K1116C、P1688C:K1116C、T1653C:N1134C、L1655C:N1134C、E1660C:N1134C、 D1678C:N1134C、D1683C:N1134C、E1684C:N1134C、Q1686C:N1134C、T1653C:E1161C、 L1655C:E1161C、K1674C:E1161C、D1676C:E1161C、E1684C:E1161C、S1687C:E1161C、 P1688C:R1204C。
[0023] 最優(yōu)選地，引入了FVIII和VWF中天然存在的氨基酸殘基的置換的一種或多 種W下組合：T1654:P1079、T1654:N1134、Q1656:D1076、F1677:K1116、D1678:R782、 I1679:K1116、Y1680:H817、Y1680:D853、Y1680:E1078、D1681:R768、E1682:R768、 D1683:R768、E1684:R768、Q1686:R768、Q1686:E1015、S1687:R768、S1687:N1134、 P1688:R768、P1688:H817、P1688:E933、P1688:L984、P1688:E1015、P1688:D1076 和 P1688:N11：M。
[0024] 優(yōu)選地，VWF和因子VIII中一個(gè)或多個(gè)插入的半脫氨酸殘基的組合中天然存在的 氨基酸是如下進(jìn)行選擇，按實(shí)施例6中所示實(shí)驗(yàn)評(píng)估的共價(jià)結(jié)合的因子VIII與VWF的相對(duì) 比率高于0. 5W及按實(shí)施例9中所示實(shí)驗(yàn)評(píng)估的因子VIII的活性。最優(yōu)選地，VWF和因子 VIII中一個(gè)或多個(gè)插入的半脫氨酸殘基的組合中天然存在的氨基酸是根據(jù)上述比率大于 1.0進(jìn)行選擇的。
[00巧]優(yōu)選地，本發(fā)明復(fù)合物中的因子VIII為遺傳工程化的因子VIII。工程化的因子VIII可具有部分或全部的B結(jié)構(gòu)域刪除，可W是包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入、刪除或 其組合的突變的因子VIII，或可W是具有半衰期延長(zhǎng)部分的融合多膚，或化學(xué)修飾的因子 VIII，如通過(guò)連接半衰期延長(zhǎng)部分而修飾，所述半衰期延長(zhǎng)部分例如聚乙二醇（PEG化）、糖 基化的PEG、徑乙基淀粉（肥S化）、聚唾液酸、彈性蛋白樣多膚、細(xì)菌肝素前體聚合物或透明