對神經(jīng)毒劑的暴露的治療的制作方法
【專利說明】對神經(jīng)毒劑的暴露的治療
[000。 發(fā)明背景 發(fā)明領域
[0002] 本申請?zhí)峁┝祟A防和治療對有機憐酸鹽試劑的暴露的毒性作用的方法。在實施方 案中，施用遞送編碼下酷膽堿醋酶的核酸分子和編碼富含聚脯氨酸的序列的核酸分子的祀 向陽離子脂質體復合物。適當?shù)?，施用是通過吸入。還提供了陽離子脂質體復合物和產生 用于此類施用的復合物的方法。
[000引發(fā)明背景
[0004] 有機憐酸鹽試劑（0巧通常用作殺蟲劑、殺昆蟲劑和用于治療醫(yī)學病況諸如青光 眼和阿爾茨海默病的藥物。不幸地是，它們還已被開發(fā)用作神經(jīng)毒劑諸如沙林、梭曼、維埃 克斯（V訝和塔崩。運些0P化合物屬于已知的最毒的化學物質。對甚至少量的暴露可W是 致命的。死亡因由橫隔肌和肋內肌的麻搏、大腦呼吸中樞的抑制、支氣管疫李、抽搖和唾液 分泌過多引起的窒息而發(fā)生（綜述于1中）。0P中毒的機理是導致酶的不可逆失活的乙酷 膽堿醋酶（Ac證）的活性位點中的絲氨酸的徑基的憐酸化。AchE(其在突觸間隙水解乙酷膽 堿（Ach))是神經(jīng)傳遞中的必需酶。AchE的失活導致Ach的快速積累，隨后產生PNS膽堿能 過度刺激和死亡。在CNS中，膽堿能過度興奮增加神經(jīng)元放電，從而觸發(fā)抽搖和急性神經(jīng)細 胞死亡。
[0005] 雖然存在用于暴露后使用的解毒治療，但它們已證明療效有限，產生嚴重的副作 用，并且沒有阻止失能（暫時性或永久性的）或不可逆的腦損傷（1，2)。因此，正在尋求預 防性措施。用于抵消0P毒性的一種方法是利用生物清除劑隔離和中和運些化合物。在所測 試的生物清除劑中，人血清下酷膽堿醋酶度化巧（也稱為假膽堿醋酶，或膽堿醋酶）似乎是 最適合于人使用的（3)。B化E是一種存在于幾乎每一個組織（包括血漿、腦、肌肉、腎、肝和 肺）中的絲氨酸酶（4)。血清中的人B化EQiB化巧（340kDa)是具有Ti/2為11-14天的球狀 四聚體分子，由四個相同的亞基組成，并且通過重糖基化（5)來免受蛋白水解。個體亞基組 裝成四聚體需要來源于lamellipodin(5)或來自大鼠膠原蛋白尾（A化EQ亞單位）的富含 聚脯氨酸的膚度on的文章，Krejci的文章，Antamirano的文章），或任何其他富含聚脯氨 酸的蛋白質的存在。B化EW相高的水平（4倍于平均基因的表達）天然表達（4)。其還在 許多含醋藥物中的降解中起著重要作用，并且是膽堿醋酶抑制劑（包括強效0P神經(jīng)毒劑） 的天然生物清除劑。
[0006] 每一個hB化E分子中和一個0P分子化）。據(jù)報道，利用重組人B化E和人血清B化E 的預處理可W保護動物（包括曬齒動物、豚鼠、豬和非人靈長類動物）免受高達5倍LDs。的 神經(jīng)毒劑的傷害化，7)。B化E與廣譜的0P毒藥的不可逆結合和其滅活作用使其成為用于 抗神經(jīng)毒劑的預防性治療的理想候選者。除了其用于多種戰(zhàn)時暴露前和暴露后場景的用途 W外，其還具有作為對用于對故意/意外神經(jīng)毒氣釋放起反應的第一反應者的預治療和作 為對殺蟲劑過度暴露、過量服用可卡因或班巧酷-膽堿誘導的呼吸暫停的暴露后治療的潛 在用途（8)。
[0007] 據(jù)估計，在人中，250mg/70千克的B化E劑量是在用一個L05。的OP攻擊后實現(xiàn)高效 保護所需要的（3)。然而，在血液中該生物清除劑酶的天然存在的量（~8-72mg/6L)太低W至于因0P與B化E的化學計量和不可逆的結合W及其間的相互作用、不利的0P/B化E質 量比和酶的老化而不能實現(xiàn)足夠的保護（4, 9)。因此，關鍵是開發(fā)顯著升高B化E在血漿中 的表達水平和量的方法。為此目的，正在制定不同的策略。最直接的方式是直接注入大劑 量高度純化的天然hB化EW增加其在血流的量。運已被證明對于抗致死劑量的梭曼和維埃 克斯的保護是成功的，但對于戰(zhàn)場使用是不實用的。此外，轉基因動物和細胞培養(yǎng)的使用尚 未能產生足夠量的hB化E來切實可行地使用。
[000引能夠自發(fā)地再活化（使得它們可用于結合并滅活另外的0P分子）的B化E突變 體的衍生是另一種具有一定成功的使用的方法。當用組氨酸取代第117位上的甘氨酸 (G117H)時B化E經(jīng)顯示獲得0P水解酶活性和增強的再活化（10, 11)。該突變體在水解乙 酷膽堿醋酶抑制劑二乙氧憐酷硫膽堿上是高效的并且還可高效地水解神經(jīng)毒劑沙林和維 ?？怂骨桑８匾氖?，表達G117H突變體的轉基因小鼠對0P具有抗性（12)。雖然已 產生60種W上的B化E突變體，但G117H仍然是最高效的突變體之一并且迄今仍在被研究 巧）。然而，迄今為止，還未開發(fā)出在通過非侵入途徑施用后在體內長時間高效地遞送或產 生B化E或活性nrtB化E的四聚體形式的方法。
[0009] 因此，存在對開發(fā)遞送B化EW預防和治療對0P試劑的暴露的技術和方法的迫切 需要。本發(fā)明通過提供用于此類治療和/或預防的基于陽離子-脂質體的藥物遞送系統(tǒng)來 滿足運些需要。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 在一個實施方案中，提供了治療或預防哺乳動物的與對有機憐憐酸鹽試劑的暴露 相關的毒性的方法。此類方法適當?shù)匕▽Σ溉閯游锸┯藐栯x子脂質體復合物，其中所述 陽離子脂質體復合物包含陽離子脂質體、直接與陽離子脂質體復合（但非化學綴合于其） 的配體、與陽離子脂質體結合的編碼下酷膽堿醋酶度Ch巧的核酸分子和與陽離子脂質體 結合的編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子。
[0012] 在實施方案中，通過選自如下途徑的途徑施用所述復合物：鼻內施用、靜脈內施 用、口服施用、舌下施用、肌內施用、病灶內施用、皮內施用、透皮施用、眼內施用、腹膜內施 用、經(jīng)皮施用、氣務劑施用、器巨內施用、腦內施用、局部施用、皮下施用、內規(guī)鏡施用、繪釋 植入物、通過滲透或機械累的施用和通過吸入的施用。
[0013] 適當?shù)?，所述配體是轉鐵蛋白、抗體和抗體片段，包括單鏈Fv抗體片段，諸如抗轉 鐵蛋白受體單鏈Fv燈fRscFv)。
[0014] 在其它實施方案中，配體祀向陽離子脂質體還包含與陽離子脂質體結合的含有 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC)(SEQIDN0:1)膚的膚。
[0015] 適當?shù)兀幋aB化E的核酸分子被包含在第一質粒中并且編碼富含聚脯氨酸的膚 的核酸分子被包含在第二質粒中。在實施方案中，編碼B化E的核酸分子被包含于第一質粒 構建體，其從5'至3'包含：(a)至少一個人腺病毒增強子序列；化）巨細胞病毒（CMV)啟動 子；（C)多克隆位點；(d)編碼B化E的核酸分子；和（e)SV40多聚A序列，其中當與野生型 腺病毒相比較時，所述質粒構建體的3'末端不包含腺病毒圖譜單位9-16。在實施方案中， 編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子被包含于第二質粒構建體，其從5'至3'包含：(a)至少 一個人腺病毒增強子序列；化）巨細胞病毒（CMV)啟動子；（c)多克隆位點；（d)編碼富含聚 脯氨酸的膚的核酸分子；和（e)SV40多聚A序列，其中當與野生型腺病毒相比較時，所述質 粒構建體的3'末端不包含腺病毒圖譜單位9-16。
[0016] 或者，編碼B化E的核酸分子和編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子存在于相同的 構建體中，但編碼B化E的核酸分子被置于美國公開專利申請?zhí)?007/0065432中公開的 高表達啟動子的下游，而編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子被置于標準啟動子諸如RSV或 CMV的下游。
[0017] 適當?shù)?，B化E是B化E的突變形式，包括B化E的突變形式為G117H突變體。
[0018] 在示例性實施方案中，陽離子脂質體包含一種或多種陽離子脂質與一種或多種中 性或輔助脂質的混合物。適當?shù)?，配體和陽離子脂質體W在約1:1至約l:l〇〇(w:w)的范圍 內的比率，例如在約1:10至約1:50 (w:w)的范圍內的比率或在約1:20至約1:40 (w:w)的 范圍內的比率存在。
[0019] 在實施方案中，陽離子脂質體包含二油酷=甲基憐酸錠與二油酷憐脂酷乙醇胺和 膽固醇的混合物；二油酷=甲基憐酸錠與膽固醇的混合物；雙十八烷基二甲基漠化錠與二 油酷憐脂酷乙醇胺和膽固醇的混合物；雙十八烷基二甲基漠化錠與二油酷憐脂酷乙醇胺的 混合物；雙十八烷基二甲基漠化錠與膽固醇的混合物或二油酷=甲基憐酸錠與二油酷憐脂 酷乙醇胺的混合物。
[0020] 適當?shù)?，陽離子免疫脂質體復合物中的核酸分子W約10:1至約1:1〇(編碼下酷 膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的 摩爾比存在，或核酸分子W約5:1至約1:5(編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾 數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適當?shù)?，核酸分子W 約4:1 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分 子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適當?shù)?，核酸分子W約2:1(編碼下酷膽堿醋酶度化巧的 核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適 當?shù)?，核酸分子W約1:1 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯 氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在。
[0021] 在實施方案中，核酸分子的總量W約1:1至約l:40(yg核酸：yg脂質體）或 約1:5至約l:20(yg總核酸：yg脂質體）的重量比存，或更適當?shù)睾怂岱肿拥目偭縒約 1:10(yg總核酸：yg脂質體）的重量比存在。
[0022] 適當?shù)兀┯脧秃衔颳治療與對至少lxLDs。的有機憐酸鹽試劑的暴露相關的毒 性，更適當?shù)豔治療與對多至lOxLDs。的有機憐酸鹽試劑的暴露相關的毒性。在實施方 案中，施用復合物W預防與對至少lxLDs。的有機憐酸鹽試劑的暴露、更適當?shù)貙Χ嘀羖Ox LDw的有機憐酸鹽試劑的暴露相關的毒性。
[0023] 在實施方案中，在對有機憐酸鹽試劑暴露之前或之后立即施用復合物。在其它實 施方案中，在對有機憐酸鹽試劑的潛在暴露之前至少6小時施用復合物。適當?shù)?，在對有機 憐酸鹽試劑的潛在暴露之前至少一周一次地施用復合物。
[0024] 適當?shù)兀溉閯游锸侨恕?br>[0025] 還提供了治療人的與對有機憐酸鹽試劑的暴露相關的毒性的方法。此類方法適當 地包括對人鼻內或通過氣霧劑吸入施用陽離子脂質體復合物，其中陽離子脂質體復合物包 含陽離子脂質體、與陽離子脂質體直接復合（但非化合綴合于其）的抗轉鐵蛋白受體單鏈Fv(TfRscFv)、包含在與陽離子脂質體結合的第一質粒中的編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核 酸分子和包含在與陽離子脂質體結合的第二質粒中的編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子。 適當?shù)?，ITRscFv和陽離子脂質體W在約1:20至約1:40 (w:w)的范圍內的比率存在，并且核 酸分子W約1:5至約l:20(yg核酸：yg脂質體）的比率存在。適當?shù)?，陽離子免疫脂質 體復合物中的核酸分子W約10:1至約1:1〇(編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾 數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或核酸分子W約5:1至 約1:5的摩爾比（編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的 膚的核酸分子的摩爾數(shù)）存在，或更適當?shù)?，核酸分子W約4:1 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧 的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更 適當?shù)?，核酸分子W約2:1 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚 脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適當?shù)?，核酸分子W約1:1 (編碼下 酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)） 的摩爾比存在。在實施方案中，施用復合物W治療與對至少lxLDw的有機憐酸鹽試劑的暴 露相關的毒性。
[0026] 還提供了用于預防人的與對有機憐酸鹽試劑的暴露相關的毒性的方法。此類方法 適當?shù)匕▽θ吮莾然蛲ㄟ^氣霧劑吸放施用陽離子脂質體復合物，其中陽離子脂質體復合 物包含陽離子脂質體、與陽離子脂質體直接復合（但非化學綴合于其）的抗轉鐵蛋白受體 單鏈FvOTRscFv)、包含在與陽離子脂質體結合的第一質粒中的編碼下酷膽堿醋酶度化巧 的核酸分子和包含在與陽離子脂質體結合的第二質粒中的編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸 分子。適當?shù)?，TTRscFv和陽離子脂質體W在約1:20至約1:40 (w:w)的范圍內的比率存在， 并且核酸分子W約1:5至約1:20 (yg核酸：yg脂質體）的比率存在。適當?shù)?，陽離子免疫 脂質體復合物中的核酸分子W約10:1至約1:1〇(編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的 摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或核酸分子W約5:1 至約1:5 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸 分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適當?shù)兀怂岱肿覹約4:1(編碼下酷膽堿醋酶度化巧 的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更 適當?shù)?，核酸分子W約2:1 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚 脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適當?shù)?，核酸分子W約1:1 (編碼下 酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)） 的摩爾比存在。在實施方案中，施用復合物W預防與對至少lxLDs。的有機憐酸鹽試劑的暴 露相關的毒性。
[0027] 還提供了將下酷膽堿醋酶度化巧遞送至哺乳動物的血流的方法。此類方法適當 地包括對哺乳動物鼻內或通過氣霧劑吸入施用陽離子脂質體復合物，其中陽離子脂質體復 合物包含陽離子脂質體、與陽離子脂質體直接復合（但非化學綴合于其）的抗轉鐵蛋白受 體單鏈Fv(TfRscFv)、陽離子脂質體、包含在與陽離子脂質體結合的第一質粒中的編碼下酷 膽堿醋酶度化巧的核酸分子和包含在與陽離子脂質體結合的第二質粒中的編碼富含聚脯 氨酸的膚的核酸分子。適當?shù)兀琁TRscFv與陽離子脂質體W在約1:20至約l:40(w:w)的范 圍內的比率存在，核酸分子W約1:5至約l:20(yg核酸：yg脂質體）的比率存在。適當 地，陽離子免疫脂質體復合物中的核酸分子W約10:1至約1:10 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧 的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或核 酸分子W約5:1至約1:5(編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯 氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適當?shù)?，核酸分子W約4:1 (編碼下酷 膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的 摩爾比存在或更適當?shù)兀怂岱肿覹約2:1 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾 數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在，或更適當?shù)?，核酸分子W 約1:1 (編碼下酷膽堿醋酶度化巧的核酸分子的摩爾數(shù)：編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分 子的摩爾數(shù)）的摩爾比存在。在實施方案中，施用復合物W導致至少250mg/70kg度化E的 重量/人的重量）的人血流中的B化E的量。
[0028] 或者，編碼B化E的核酸分子和編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子存在于相同的 構建體中，但編碼B化E的核酸分子被置于美國公開專利申請?zhí)?007/0065432 (通過引用W 其整體并入本文）中公開的高表達啟動子的下游，而編碼富含聚脯氨酸的膚的核酸分子被 置于標準啟動子諸如RSV或CMV的下游。
[0029] 附圖概述
[0030] 圖1顯示在來自祀向陽離子免疫脂質體遞送的轉移瘤中轉基因表達的存在。
[0031] 圖2顯示作為將基因置于本文中所述的高表達啟動子的控制下的結果的蛋白質 表達的增加。
[0032] 圖3A和3B顯示至利用具有含有GFP基因的pSCMV高表達質粒（圖3A)或具有巧 光標記的寡核巧酸（圖3B)的scL注射的Ba化/C小鼠的腦的scL遞送。
[0033] 圖4A-4B顯示通過頸內靜脈置管在大鼠中注射的祀向1TR并且具有編碼GFP的質 粒（lOOygcDNA)的脂質體復合物的腦切片。
[0034] 圖5顯示在對Ba化/c小鼠鼻內施用后，W游離（未被封裝的）或scL封裝的質粒 DNA形式存在的巧光素酶基因的表達水平。
[0035] 圖6顯示使用檢測E服I和E服II蛋白的抗體進行的總細胞蛋白質的Western分 析。
[0036] 圖7顯示將wt-BChE、mt-BChE和ppro基因亞克隆進pSCMV載體的結果。
[0037] 圖8顯示wt-B化E、mt-B化E和卵ro基因在pSCMV載體中的超螺旋結構的百分比。
[0038] 圖9顯示在用遞增量的sckm巧化E/ppro復合物中的DNA轉染后C冊-K1細胞中 的B化E的表達水平。
[0039] 圖10顯示在用scL-m巧化E/ppro復合物體外轉染A549細胞后16天B化E的表達。
[0040] 圖11顯示在用scL-nrtB化E/ppro復合物體外轉染A549細胞后28天B化E的表達。 [00川發(fā)明詳述
[0042] 術語"復合物"、"納米復合物"、"脂質體復合物"和"納米脂質體"在本說明書 中可互換地用于指本文中公開的陽離子脂質體。用于本發(fā)明的實踐的示例性陽離子脂質體 及其產生方法公開于美國公開專利申請?zhí)?003/0044407和2007/0065499中，其每一個的 公開內容通過引用W其整體并入本文。
[0043] 如本文中所用，術語"約"是指引用值，W及在該引用值的10%內的值。例如，" 約100皿"包括90皿至110皿的值，包括在該范圍之間的值。
[0044] 如本文中所用，術語"配體"是指可化學綴合于陽離子脂質體或與其直接結合/ 復合（但非化學綴合于其）的任何合適的祀向部分。用于本發(fā)明的實踐的示例性配體包 括，但不限于，蛋白質（例如，轉鐵蛋白或葉酸）、膚（例如，L-37pA)、抗體、抗體片段（包括 Fab'片段和單鏈Fv片段）和糖類（例如，半乳糖）化及其它祀向分子。
[0045] 示例性方法和組合物公開于美國公開專利申請?zhí)?003/0044407和2007/0065499 中，其中按照本發(fā)明的實施方案的復合物通過簡單高效的非化學綴合來產生。示例性方法 和組合物公開于美國專利號7, 479, 276中，其中按照本發(fā)明的實施方案的復合物通過化學 綴合來產生。運些專利和專利申請的每一個的公開內容通過引用W其整體并入本文。
[0046] 在示例性實施方案中，完整抗體或抗體片段可用作制備本發(fā)明的復合物的配體。 在適當?shù)膶嵤┓桨钢?，使用抗體片段，包括抗體的F油片段和單鏈Fv片段（scFv)。一 種合適的抗體是抗轉鐵蛋白受體（抗TfR)單克隆抗體，并且合適的抗體片段是基于抗 1TR單克隆抗體的scFv。合適的抗1TR單克隆抗體是祀9(參見，例如，化yes，B.F.，等 人，"CharacterizationofaMonoclonalAntibody巧E9)thatDefinesaHumanCell SurfaceAntigenofCellActivation, "J.Immunol. 127:347-352 (1981) ;Batra,J.K.， 等人，"Single-chainTmmunotoxinsDirectedattheHumanTransferrinReceptor ContainingPseudomonasExotoxinAorDiphtheriaToxin:anti-TFR(Fv)-PE40and DT388-anti-TFR(Fv), "Mol.Cell.Biol. 11:2200-2205(1991)(其公開內容通過引用并入本 文）?；谕耆笽TR單克隆抗體的scFv含有被該MAb識別的ITR的表位的完整抗體結合 部位（作為分子量約為26, 000的單鏈多膚）。scFv通過將分別來自重鏈和輕鏈的組分VH 和化可變結構域與適當?shù)卦O計的膚連接來形成，所述膚橋連第一可變區(qū)的C末端和第二可 變區(qū)的N末端，順序為VH-膚-VL或Vk膚-VH。另外的配體，諸如本說明書中描述的配體， 也可用于本發(fā)明的實踐。
[0047] 在一個實施方案中，將半脫氨酸部分（moiety)添加至scFv的C末端。雖然不希 望受理論束縛，但據(jù)信，提供游離琉基的半脫氨酸可在化學綴合和非化學綴合實施方案中 增強抗體與脂質體之間的復合物的形成。在使用或不使用半脫氨酸的情況下，可在大腸桿 菌巧.coli)的包涵體中表達蛋白，隨后重折疊W產生呈活性形式的抗體片段。
[0048] 除非想要在復合物的形成中使用空間上穩(wěn)定的脂質體，否則制備本發(fā)明的示例 性非化學綴合的復合物中的第一步驟包括將陽離子脂質體或脂質體與選擇的抗體或抗體 片段的組合混合。各種陽離子脂質體可用于本發(fā)明的復合物的制備。公開的PCT申請 W099/25320(其公開內容通過引用W其整體并入本文）描述了幾種陽離子脂質體的制備。 合適的脂質體的實例包括憐脂酷膽堿（PC)、憐脂酷絲氨酸（P巧和包含二油酷=甲基憐酸 錠值0TA巧與二油酷憐脂酷乙醇胺值0P巧的混合物、D0TAP與DO陽和/或膽固醇（chol) 的混合物；雙十八烷基二甲基漠化錠值DAB)和DO陽和/或chol的混合物或DDAB與DOPE 的混合物。脂質的比率可被改變W優(yōu)化特定祀細胞類型對治療性分子的攝取效率。脂質體 可包含一種或多種陽離子脂質與一種或多種中性或輔助脂質的混合物。所需的陽離子脂質 對中性或輔助脂質的比率為約1: (0. 5-3)，優(yōu)選地1: (1-2)(摩爾比）。
[0049] 適當?shù)呐潴w，例如，蛋白質/膚、抗體或抗體片段，是可結合祀細胞的表面，和優(yōu)選 地結合在祀細胞上差異表達的受體的配體。將配體在室溫下W在約1:10至約1:50、適當?shù)?約1:20至約1:40 (w:w)的范圍內的配體（例如，蛋白質）：脂質比率（重量：重量）與陽 離子脂質體或聚合物混合。
[0050] 讓配體（例如，蛋白質/膚、抗體或抗體片段）和脂質體在室溫下短暫溫育，通常 約10-15分鐘，隨后將混合物與選擇的治療劑或診斷劑混合?？膳c脂質體復合物復合的治 療性分子或試劑的實例包括基因、高分子量DNA(基因組DNA)、質粒DNA、反義寡核巧酸、膚、 核酶、核酸（包括siRNA、miRNA和反義核酸）、小分子、病毒顆粒、免疫調節(jié)劑、用于成像的 造影劑、蛋白質和化學試劑。
[0051] 將配體（例如，蛋白質/膚、抗體或抗體片段）和脂質體組合W在約0.5:1至約 1:40(y g的試劑：nmol的總脂質），適當?shù)丶s1:10至1:20(y g的試劑：nmole的總脂質） 的范圍內的比率與治療劑混合，并在室溫下短暫溫育，通常約10至15分鐘。對于體內使 用，將50%葡萄糖或50%薦糖添加至5-20% (V:V)的終濃度并通過輕輕翻轉混合5-10秒， 或對于更大體積，W20-30RPM旋轉1-2分鐘。如使用MalvernZETASIZER?3000 或MalvernZETASIZER?NANO-ZS通過動態(tài)光散射測量的，脂質體復合物的尺寸通 常在約50-500nm的范圍內。參見美國公開專利申請?zhí)?003/0044407和美國專利申請?zhí)?11/520, 796,其公開內容通過引用W其整體并入本文。
[0052] 在本發(fā)明的一個實施方案中，用于形成復合物的脂質體是空間上穩(wěn)定的脂質體。 空間上穩(wěn)定的脂質體是已將親水性聚合物諸如陽G、聚（2-乙基丙締酸）或聚（n-異丙基丙 締酷胺HPNIPAM)整合進其中的脂質體。當與治療劑復合時，此類經(jīng)修飾的脂質體可W是 特別有用的，因為它們被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)從血流清除的速度通常沒有未被運樣修飾的可比較 的脂質體快。為了制備本發(fā)明的空間上穩(wěn)定的脂質體復合物，將混合抗體或抗體片段、脂質 體和治療劑或診斷劑的順序從上文所示的順序反過來。在第一步驟中，首先將上述陽離子 脂質體與上述治療劑W在約0. 5:1至約1:40 (yg的試劑：nmol的脂質）、適當?shù)丶s1:10至 1:20(yg的試劑：nmole的脂質）的范圍內的比率混合。W約0. 1:1〇〇(皿〇1的陽G:nmol 的脂質體）、適當?shù)丶s0. 5:50 (例如約1:40 (nmol的PEG:nmol的脂質體））的比率向該脂復 合物中添加