用于治療和/或預防再狹窄的藥物制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明大體上設及用于在需要其的受試者中治療和/或預防再狹窄的藥物制劑。 還提供治療和/或預防的方法。
【背景技術】
[0002] 每年全世界有3000萬W上的患者進行開放式外科血管重建，所述開放式外科血 管重建被定義為使用移植物改善身體部位或器官的血液供應。不幸的是，5年內(nèi)20-50%的 病例發(fā)生移植物失效，運主要由于吻合位點處的狹窄導致閉塞[1]。
[0003] 在血管內(nèi)介入的情況中，已確定醫(yī)療器械（例如支架或普通氣囊）在預防管腔內(nèi) 血管狹窄方面具有有前景的效果。然而，當開放式血管重建是強制性的時，沒有可用的平臺 用于局部藥物遞送。目前的開放式血管重建后的治療意味著具有副作用風險的反復口服給 予活性化合物。
[0004] 為了通過避免發(fā)生狹窄而增加再灌注的可能性，在手術部位應用局部（local)預 防性治療將比全身用藥更加安全和有效。為了有效，局部治療需要保持定位于用藥部位并 根據(jù)通過病理學發(fā)展確定的最佳時間表遞送藥物。運樣的制劑還需要是生物相容的和可生 物降解的，其經(jīng)水解或酶解而被消除，避免二次手術移除該藥物遞送裝置。此外，它應該W 小體積遞送，對人類約5ml，并且不應該損傷移植物或周圍組織。 陽0化]盡管已經(jīng)在動物模型中測試了血管周給藥途徑，但是該方法的成功是有限的。迄 今，市場上仍然沒有臨床應用。運種有限的成功的原因在于可行性限制。到目前為止，還沒 有使用生物相容的和可生物降解的聚合物用于預防性治療開放式外科血管重建后的再狹 窄且具有適合病理學發(fā)展的最佳藥物釋放特性的制劑在患病部位實現(xiàn)長期局部持久性。
[0006] 通過提供本發(fā)明的用于在需要其的受試者中治療和/或預防再狹窄的藥物制劑， 本發(fā)明已經(jīng)實現(xiàn)了運些目標。
【附圖說明】
[0007]圖1:根據(jù)IH的發(fā)展，具有最佳釋放動力學特性的本發(fā)明的圖示。使快速遞送的 對急性炎癥期有效的本發(fā)明的化合物或其任何活性代謝物負載到水凝膠中，并在再狹窄發(fā) 展的早期釋放。由于水凝膠的固有粘度，其將確保藥物遞送系統(tǒng)的局部化持續(xù)需要的時間。 負載于微球中的對再狹窄的后期有效的本發(fā)明的第二化合物或其任何活性代謝物，將W持 續(xù)的方式釋放，例如在本圖中釋放長達4周。
[000引圖2 :從滲有ATV的水凝膠中的釋放動力學。將不同量的阿托伐他?。ˋTV)滲入 水凝膠（2. 5yM、5yM、10yM)中。對所有的樣品，ATV在12小時內(nèi)從水凝膠中釋出。水凝 膠的保留作用是可忽略的。未觀察到=個不同濃度之間的釋放特性的顯著差異（t-檢驗， P> 0. 0f5)。
[0009] 圖3 :從水凝膠中釋放的ATV降低人血管平滑肌細胞化VSMC)的活力。如通過MTT 試驗所評價的，hVSMC的活力被5-10iiMATV顯著降低，不論藥物被直接加入培養(yǎng)基質(zhì)（培 養(yǎng)基）或由水凝膠（凝膠）釋放。運個變化在IOyMATV(24h)存在下比在5yMATV(7化） 存在下更快，相比在ATV不存在下培育的各細胞（對照）而言，*P< 0. 05。
[0010] 圖4 :滲有ATV的水凝膠減少hVSMC的遷移（migration)。
[0011] 上圖：使用畫出了~500ym的不含細胞的間隙（線）的娃培養(yǎng)基插入物（silicon 州；L^reinsert)評價原代hVSMC的遷移速率。在對照條件（對照培養(yǎng)基）下生長的hVSMC 遷移進入此間隙并在約4她內(nèi)將其填滿。此遷移被5和10yMATV減少，不論藥物被直接 加入培養(yǎng)基（ATV培養(yǎng)基）或由水凝膠（ATV凝膠）釋放。棒代表80ym。 陽01引下圖：ATV被直接加入培養(yǎng)基時（左圖），在5yMATV存在下在36h時觀察到細胞 遷移的抑制，在IOiiMATV存在下在24h時就已經(jīng)觀察到細胞遷移的抑制。使用負載ATV 的水凝膠觀察到類似的hVSMC遷移的抑制（右圖）。相比不存在ATV時培育的對照細胞而 言，女P< 0. 05,女女P< 0. 01。
[0013] 圖5 :滲有ATV的水凝膠減少移行（transmigration)。
[0014] 上圖：采用改良的Boyden室技術評價ATV存在或不存在時hVSMC的移行。
[0015] 下圖：移行的細胞的定量評價證明在ATV存在于培養(yǎng)基中或由水凝膠釋放時顯 著降低hVSMC移行的能力。相比不存在ATV時培育的對照細胞而言，*P< 0. 05、* *P <0.Ol和***?<0. 001。棒代表 20ym。
[0016] 圖6 :hVSMC的轉錄物和蛋白質(zhì)的分析。在被直接加入培養(yǎng)基的ATV存在下進行 hVSMC中各mRNA水平的測量。培育24小時之后，PAI-1、MMP2和Cx43mRNA的水平降低，而 tPA和HMOX轉錄物增多。當ATV從水凝膠釋出時，在24h時未觀察到顯著變化。相反，在從 水凝膠釋出的ATV存在下，在48小時后觀察到測試基因的類似調(diào)控。相比沒有ATV培育的 細胞（對照）而言，*P< 0. 05、* *P< 0.Ol和 * * *P< 0. 001。
[0017] 圖7 :負載阿托伐他汀的PLGA微球及其截面的掃描電子顯微照片。微球是球形的、 光滑的，平均粒徑為10ym(左圖），具有實屯、的內(nèi)部結構（右圖）。
[0018] 圖8 :來自負載于微球中的ATV和/或滲入凝膠中的游離ATV的ATV累積釋放（上 圖）和非累積釋放（下圖）。通過調(diào)整顆粒和凝膠負荷而將制劑中ATV的總量保持恒定為 Img/ml。命名：G-M+:滲入水凝膠中的負載ATV的微球，G+M-:滲入水凝膠中的游離ATV和 不含藥物的微球，G+M+ :滲入水凝膠中的游離ATV和負載ATV的微球。包封阿托伐他汀的微 球的存在顯著延緩從制劑中的釋放。
[0019] 圖9 :在滲入水凝膠中的負載ATV的顆粒和/或游離ATV的存在下內(nèi)膜增生（IH) 的發(fā)展減緩。
[0020] 上圖：經(jīng)歷CAL模型的WT小鼠的頸動脈的代表性橫截面的顯微照片 (Verhoeff-vanGieson彈性蛋白染色）（放大率X10)。使用未處理的小鼠作為對照。所 有被處理的小鼠都接受總的恒定的ImM的ATV濃度，ATV在水凝膠中似和/或在負載（+) 或未負載（-)的微球中（M)，例如在G+M+的情況下，G+ = 500yM并且M+ = 500yM，而在 G-M+的情況下，G- :0mM并且M+ =ImM。
[0021] 中圖：初步的結果表明，相比WT對照小鼠，手術后第14天和28天時，采用負載ATV 的微球處理的動物的內(nèi)膜厚度顯著減小。 陽0巧下圖：第14天（左圖）和28天（右圖）時，在距結扎位點不同距離處所顯示的內(nèi) 膜/中膜比（I/M)的定量評價證明，與對照相比，在ImM負載ATV的微球的存在下，在結扎 后第14和28天時，結扎的頸動脈的內(nèi)膜/中膜比在距結扎0. 5、1、I. 5和2mm處減小。 陽02引 圖10:ATV從負載ATV的微球中的延長釋放動力學。此批微球是采用聚值，k丙 交醋-共-乙交醋HResomerRG503)制備的。釋放持續(xù)長達52天。
[0024]圖11 :ATV和阿司匹林（ASA)從滲入水凝膠中的負載ATV的微球和游離ASA的釋 放動力學。該凝膠包含400ygASA每ml水凝膠和Img包封于微球中的ATV每ml水凝膠。 命名：Gas:滲入水凝膠中的游離ASA，GMat:滲入水凝膠中的負載ATV的微球，GasMatASA: 滲入水凝膠中的游離ASA和負載ATV的微球，ASA的結果，GasMatATV:滲入水凝膠中的游離 ASA和負載ATV的微球，ATV的結果。ASA在2天內(nèi)快速釋放，而ATV甚至在4周后仍然釋 放。
[00巧]圖12 :負載紫杉醇（PT訝的RG503微球的光投射顯微照片，所述微球的平均粒徑 為 29Jim。
[0026]圖13 :PTX和阿司匹林（ASA)從滲入水凝膠中的負載PTX的微球和游離ASA的釋 放動力學。該凝膠包含400ygASA每ml水凝膠和4mg包封于微球中的PTX每ml水凝膠。 命名：Gas:滲入水凝膠中的游離ASA，GMpa:滲入水凝膠中的負載PTX的微球，GasMpaASA: 滲入水凝膠中的游離ASA和負載PTX的微球，ASA的結果，GasMpaPTX:滲入水凝膠中的游 離ASA和負載PTX的微球，PTX的結果。在運些加速的釋放條件下，ASA在4天內(nèi)完全釋放， PTX的釋放持續(xù)10天。 陽〇八]發(fā)巧概沐
[0028] 本發(fā)明提供用于在需要其的受試者中治療和/或預防再狹窄的藥物制劑，所述藥 物制劑存在于凝膠相中，所述凝膠相包含
[0029] i)至少一種快速遞送的對急性炎癥期有效的化合物或所述至少一種化合物的任 何活性代謝物，和
[0030] ii)持續(xù)釋放制劑，其包含至少一種對再狹窄發(fā)展后期有效的化合物或所述至少 一種化合物的任何活性代謝物。
[0031] 還公開了在需要其的受試者中治療和/或預防再狹窄的方法，所述方法包括給予 存在于凝膠相中的藥物制劑，所述凝膠相包含i)至少一種快速遞送的對急性炎癥期有效 的化合物或所述至少一種化合物的任何活性代謝物，和ii)持續(xù)釋放制劑，其包含至少一 種對再狹窄發(fā)展后期有效的化合物。
[0032] 本發(fā)明還提供了用于治療和/或預防再狹窄的試劑盒，其包含用于在需要其的受 試者中治療和/或預防再狹窄的藥物制劑，所述藥物制劑存在于凝膠相中，所述凝膠相包 含i)至少一種快速遞送的對急性炎癥期有效的化合物或所述至少一種化合物的任何活性 代謝物，和ii)持續(xù)釋放制劑，其包含至少一種對再狹窄發(fā)展后期有效的化合物或所述至 少一種化合物的任何活性代謝物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[003引超急性階段由現(xiàn)存的真正的內(nèi)膜襯里的損傷啟動。hVSMC(人血管平滑肌細胞）的 增殖通過兩種機制（包括損傷的內(nèi)皮細胞和hVSMC增殖）開始。急性階段的特征為血栓的 形成、內(nèi)皮細胞向內(nèi)生長和生長因子的釋放。在此階段，損傷后數(shù)小時至數(shù)周，細胞外基質(zhì) 巧CM)的完整性受到影響，運刺激hVSMC從中膜遷移至內(nèi)膜巧]。在內(nèi)膜增生（IH)的第S