穩(wěn)定化的可溶性融合前rsv f多肽的制作方法
【專利說(shuō)明】穩(wěn)定化的可溶性融合前RSVF多化
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明尤其設(shè)及重組融合前RSVF多膚和它們例如在免疫 原性組合物中的用途。
[000引發(fā)明背景
[0003] 呼吸道合胞體病毒巧SV)是一種屬于副黏液病毒科肺病毒屬的包膜的不分節(jié)段 的負(fù)鏈RNA病毒。據(jù)估計(jì)全世界每年發(fā)生6400萬(wàn)例RSV感染，引起160. 000例死亡（WHO 急性呼吸道感染 20099 月最新（WHOAcuteRespiratoryInfectionsUpdateS^tember 2009))。最嚴(yán)重的疾病尤其發(fā)生在早產(chǎn)兒、老年人W及免疫受損的個(gè)體中。在不足2歲的 兒童中，RSV是最常見(jiàn)的呼吸道病原體，占到因呼吸道感染而住院治療的約50%，其中住院 治療的最高峰發(fā)生在2-4月齡。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了幾乎所有的兒童在兩歲W前都會(huì)被RSV感染。 在一生中的反復(fù)感染被歸于低效的天然免疫力。老年人中的RSV疾病負(fù)擔(dān)水平、死亡率W 及發(fā)病率僅次于由非流行性A型流感感染所引起的那些。
[0004] 為了感染一個(gè)宿主細(xì)胞，RSV，像比如流感病毒和HIV的其他包膜病毒一樣，需要 病毒膜與一個(gè)寄主細(xì)胞膜的融合。對(duì)于RSV，保守的融合蛋白質(zhì)巧SVF蛋白質(zhì)）將病毒與 宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行融合。在當(dāng)前的模型中，基于副黏液病毒研究，RSVF蛋白質(zhì)最初折 疊成一種"融合前"構(gòu)象。在細(xì)胞進(jìn)入期間，該融合前構(gòu)象進(jìn)行再折疊和構(gòu)象變化成其"融 合后"構(gòu)象。因此，該RSVF蛋白質(zhì)是一種亞穩(wěn)的蛋白質(zhì)，它通過(guò)最初折疊成一種亞穩(wěn)形式 (融合前構(gòu)象），該亞穩(wěn)形式隨后進(jìn)行不連續(xù)/逐步的構(gòu)象變化成一個(gè)較低能量的構(gòu)象（融 合后構(gòu)象），將不可逆的蛋白質(zhì)再折疊連接到膜鄰近來(lái)驅(qū)動(dòng)膜融合。
[0005] 從RSV-F的電子顯微鏡術(shù)很清楚，融合前與融合后FS聚物之間存在巨大 的結(jié)構(gòu)差異，運(yùn)已經(jīng)在最近通過(guò)結(jié)晶學(xué)確認(rèn)（麥格勒朗（McLellanJ.S.)等人《科 學(xué)》（Science) 340 化 136) :1113-7(2013)和麥格勒朗（McLellanJ.S.)等人《科學(xué)》 342化158) :592-8 (2013))。運(yùn)些觀測(cè)結(jié)果表明融合前和融合后RSVF蛋白質(zhì)在抗原性上是 獨(dú)特的（柯?tīng)栠_(dá)（Calder，LJ.)等人《病毒學(xué)》（Virology) 271，122-131 (2000))。
[0006] 雖然當(dāng)前不可獲得一種針對(duì)RSV感染的疫苗，但是需要?；谠揜SVF蛋白質(zhì)的 候選疫苗已經(jīng)由于例如穩(wěn)定性、純度、再現(xiàn)性W及效能的問(wèn)題而失敗。如上所指出，晶體結(jié) 構(gòu)已經(jīng)掲露了融合前與融合后狀態(tài)之間巨大的構(gòu)象變化。重排的程度表明僅針對(duì)RSV-F 的融合后構(gòu)象的一部分抗體將能夠與該病毒表面上的融合前刺突的天然構(gòu)象進(jìn)行交叉反 應(yīng)。因此，產(chǎn)生一種針對(duì)RSV的疫苗的嘗試已經(jīng)集中在對(duì)含有RSVF蛋白質(zhì)的融合前形 式的疫苗進(jìn)行研發(fā)（參見(jiàn)例如WO20101149745、WO2010/1149743、WO2009/1079796、WO 2012/158613)。然而，運(yùn)些嘗試尚未得到穩(wěn)定的可W用作用于在人類中進(jìn)行測(cè)試的候選物 的融合前RSVF多膚。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供穩(wěn)定、重組、融合前的呼吸道合胞體病毒巧SV)融合（巧多膚，即穩(wěn)定 化在融合前構(gòu)象的重組RSVF多膚。本發(fā)明的RSVF多膚包含至少一個(gè)對(duì)該融合前構(gòu)象F 蛋白質(zhì)具有特異性的表位。在某些實(shí)施例中，運(yùn)些融合前RSVF多膚是可溶性的。在某些 實(shí)施例中，運(yùn)些多膚與膜結(jié)合。本發(fā)明還提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的融合前RSVF多膚的核 酸分子和包含運(yùn)些核酸分子的載體。
[0009] 本發(fā)明還設(shè)及到包含一種RSVF多膚、一種核酸分子和/或一種載體的組合物，優(yōu) 選地是免疫原性組合物，W及它們?cè)谡T發(fā)一種針對(duì)RSVF蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)中的用途，尤其 它們作為一種疫苗的用途。本發(fā)明還設(shè)及到用于在一名受試者中誘發(fā)一種抗呼吸道合胞體 病毒巧SV)免疫反應(yīng)的方法，包括向該受試者給予有效量的一種融合前RSVF多膚、編碼所 述RSVF多膚的一種核酸分子和/或包含所述核酸分子的一種載體。優(yōu)選地，該誘發(fā)的免疫 反應(yīng)特征為針對(duì)RSV的中和抗體和/或針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫。在具體方面，本發(fā)明設(shè)及 到用于在一名受試者中誘發(fā)中和抗呼吸道合胞體病毒巧SV)F蛋白質(zhì)抗體的一種方法，包 括向該受試者給予有效量的一種免疫原性組合物，該免疫原性組合物包含一種融合前RSV F多膚、編碼所述RSVF多膚的一種核酸分子和/或包含所述核酸分子的一種載體。
[0010] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0011] 圖1 :A)來(lái)自離子交換柱的洗脫液A2_F24N67I+S215P的Superdex200凝膠過(guò) 濾色譜圖。運(yùn)些箭頭指示標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（1-甲狀腺球蛋白669kDa、2-鐵蛋白440kDaW及 3-IgG150kDa)的洗脫點(diǎn)。B)在還原條件下來(lái)自SEC色譜圖的含有融合前F蛋白質(zhì)的峰的SDS-PACiE分析。
[0012] 圖2 :裝載了含有W下各項(xiàng)的樣品的非變性聚丙締酷胺凝膠電泳（化tivePACiE)的 蛋白質(zhì)印跡：1)來(lái)自于表達(dá)具有異亮氨酸拉鏈（S)F43的融合前構(gòu)建體的細(xì)胞的上清液；2) 來(lái)自于表達(dá)主要=聚物（頂部帶）融合后RSVF蛋白質(zhì)的細(xì)胞的上清液；W及3)純化的= 聚物融合前A2_F24N67I。
[001引圖3 :相對(duì)于未突變A2_F24的點(diǎn)突變的構(gòu)建體的表達(dá)水平。
[0014] 圖4展示實(shí)例6中所述的方法的結(jié)果：(A)，確定50%CR9501結(jié)合損失所在 的溫度；度）展示當(dāng)通過(guò)50 %融合前特異性抗體CR9501結(jié)合損失評(píng)估時(shí)融合前F(A2_ F24N671+S215巧與未經(jīng)修飾的胞外結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性的比較。
[0015] 圖5 :在第1、5W及33天的Octet測(cè)量，展示融合前特異性抗體CR9501與融合前 構(gòu)建體的結(jié)合的存儲(chǔ)-時(shí)間依賴性損失；A)A2_F24(SEQIDN0:19)，B)A2_F24K465Q，C)A2_ F24S46G，D)A2_F24N67IW及巧A2_F24E92D。
[0016] 圖6 :在第1、5W及33天的Octet測(cè)量，展示融合前特異性單克隆抗體CR9501 與融合前構(gòu)建體的結(jié)合的存儲(chǔ)-時(shí)間依賴性損失；A)A2_F24K465Q，B)A2_F24K465Q+N67I， C)A2_F24S46G,D)A2_F24S46G+E92D,E)A2_F24S46G+N67I,F)A2_F24E92D,G)A2_ F24S46G巧92D，H)A2_F24N67I巧92DW及I)A2_F24E92D+S215P。
[0017] 圖7 :在第0和4周用根據(jù)表14的免疫原和劑量進(jìn)行初免加強(qiáng)后在第6周小鼠的 VNA滴度。
[0018] 圖8 :在第0和4周用根據(jù)表15的免疫原和劑量進(jìn)行初免加強(qiáng)后在第7周棉鼠的 VNA滴度。
[0019] 圖9 :在鼻內(nèi)RSV攻擊后第5天肺和鼻的病毒負(fù)荷量。
[0020] 發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明
[0021] 呼吸道合胞體病毒巧SV)的融合蛋白質(zhì)（巧設(shè)及到病毒膜與一種宿主細(xì)胞膜的融 合，此融合是感染所需要的。RSVFmRNA被翻譯成一種稱為FO的574氨基酸前體蛋白質(zhì)，它 在N-末端含有一個(gè)信號(hào)膚序列（例如SEQIDNO: 1的氨基酸殘基1-26)，該信號(hào)膚序列通 過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種信號(hào)膚酶去除。FO在兩個(gè)位點(diǎn)（氨基酸殘基109/110與136/137之間） 通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基氏體中的細(xì)胞蛋白酶（尤其是弗林蛋白酶）裂解，去除一個(gè)短的糖基化的 插入序列（還稱作一個(gè)p27區(qū)，包含氨基酸殘基110到136,并且產(chǎn)生被稱為Fl和F2的兩 個(gè)結(jié)構(gòu)域或亞單元。該Fl結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基137-574)在其N-末端含有一個(gè)疏水性融 合膚并且C-末端含有跨膜燈M)(氨基酸殘基530-550)和胞質(zhì)區(qū)（氨基酸殘基551-574)。 該F2結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基27-109)通過(guò)兩個(gè)二硫橋鍵共價(jià)連接到Fl。該F1-F2雜二聚物 在病毒粒子中被裝配成同=聚物。
[0022] 雖然當(dāng)前不可獲得一種針對(duì)RSV感染的疫苗，但是需要。產(chǎn)生一種疫苗的一種可 能的方法是基于純化的RSVF蛋白質(zhì)的一種亞單元疫苗。然而，對(duì)于此方法來(lái)說(shuō)，所希望的 是該純化的RSVF蛋白質(zhì)處于類似RSVF蛋白質(zhì)的融合前狀態(tài)的構(gòu)象的隨時(shí)間推移穩(wěn)定的 一種構(gòu)象，并且可W按足夠的量產(chǎn)生。另外，對(duì)于一種基于亞單元的疫苗來(lái)說(shuō)，該RSVF蛋 白質(zhì)需要通過(guò)跨膜（TM)和胞質(zhì)區(qū)的缺失來(lái)截短W產(chǎn)生一種可溶性的分泌的F蛋白質(zhì)（S巧。 因?yàn)門M區(qū)負(fù)責(zé)膜的錯(cuò)定和S聚，所W無(wú)錯(cuò)的可溶性F蛋白質(zhì)比全長(zhǎng)蛋白質(zhì)要不穩(wěn)定得多， 并且將容易再折疊成融合后終末狀態(tài)。為了獲得呈穩(wěn)定的融合前構(gòu)象的展示高表達(dá)水平和 高穩(wěn)定性的可溶性F蛋白質(zhì)，融合前構(gòu)象因此需要進(jìn)行穩(wěn)定化。
[0023] 對(duì)于副流感類型5 (PIV5)已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)另一副黏液病毒F蛋白質(zhì)穩(wěn)定化在融合 前構(gòu)象。殷（Yin)等人（《自然》(化Uire)439:38-44(2006))因此通過(guò)F。中弗林蛋白酶裂 解位點(diǎn)的封阻進(jìn)展到Fl和F2的突變來(lái)穩(wěn)定化PIV-5F蛋白質(zhì)的融合前結(jié)構(gòu)。此外，跨膜 (TM)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被一種眾所周知的螺旋狀=聚結(jié)構(gòu)域GCMpII置換。此結(jié)構(gòu)域形成一種 =聚的螺旋狀卷曲螺旋結(jié)構(gòu)并且是天然二聚的螺旋狀卷曲螺旋膚GCN4的一種修飾（奧謝 (0'Shea)等人，《科學(xué)》243:538-542(1989))。其中GCN4亮氨酸拉鏈的氨基酸序列在屯膚 區(qū)化巧tad)的每個(gè)a和d位置上被異亮氨酸殘基取代的GCN4-PII膚展示形成一種=鏈平 行的a-螺旋狀卷曲螺旋（哈伯瑞（Harbury)等人，《科學(xué)》262:1401-1407(1993))。
[0024] 對(duì)于RSVF穩(wěn)定化在融合前構(gòu)象，已經(jīng)試驗(yàn)過(guò)相同的策略，比如例如弗林蛋白酶裂 解位點(diǎn)的突變和RSV-F胞外結(jié)構(gòu)域與一種GCN4pIIS聚結(jié)構(gòu)域（如例如WO2010/149743、 WO2010/149745、WO2009/079796、WO2012/158613 中披露）或與次要纖維蛋白 (fibritin)S聚結(jié)構(gòu)域（麥格勒朗（MCLellan)等人，《自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》(化化reStruct. Biol. ) 17:2-248-250(2010))的融合。此次要纖維蛋白結(jié)構(gòu)域或'福爾頓（Foldon) '衍生 自T4次要纖維蛋白并且早期是被描述為一種人工的天然=聚結(jié)構(gòu)域（賴塔夫化etarov) 等人，《生物化學(xué)莫斯科版》度iochemistryMoscow)64:817-823(1993);古斯（S-Guthe)等 人，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.) 337:905-915. (2004))。然而，運(yùn)些嘗試未產(chǎn)生穩(wěn)定的 融合前RSV-F蛋白質(zhì)。此外，運(yùn)些嘗試尚未產(chǎn)生適于在人類中進(jìn)行測(cè)試的候選物。
[00巧]本發(fā)明目前提供了重組的穩(wěn)定的融合前RSVF多膚，即穩(wěn)定化在融合前構(gòu)象的RSV F多膚。在產(chǎn)生本發(fā)明的研究中，將若干修飾步驟引入和/或組合W獲得所述穩(wěn)定的可溶性 融合前RSVF多膚。本發(fā)明的穩(wěn)定的融合前RSVF多膚處于融合前構(gòu)象，即它們包含（顯 示）至少一個(gè)對(duì)融合前構(gòu)象F蛋白質(zhì)具有特異性的表位。一個(gè)對(duì)融合前構(gòu)象F蛋白質(zhì)具有 特異性的表位是一個(gè)在融合后構(gòu)象中未呈現(xiàn)的表位。不希望受任何具體的理論束縛，相信 RSVF蛋白質(zhì)的融合前構(gòu)象可化含有與在天然RSV病毒粒子上表達(dá)的RSVF蛋白質(zhì)上的表 位相同的表位，并且因此可W提供用于引起保護(hù)性中和抗體的優(yōu)點(diǎn)。
[0026] 在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的多膚包含被W下各項(xiàng)識(shí)別的至少一個(gè)表位：一種融合 前特異性單克隆抗體，包含SEQIDNO:54的一種重鏈CDRl區(qū)、SEQIDNO:55的一種重鏈 CDR2區(qū)、沈QIDNO: 56的一種重鏈CDR3區(qū)和沈QIDNO:62的一種輕鏈CDRl區(qū)、沈QID ^:63的一種輕鏈〔032區(qū)^及569 10^:64的一種輕鏈〔01?3區(qū)（下文稱為0?9501);和/ 或一種融合前特異性單克隆抗體，包含SEQIDN0:58的一種重鏈CDRl區(qū)、SEQIDN0:59的 一種重鏈CDR2區(qū)、SEQIDNO: 60的一種重鏈CDR3區(qū)和沈QIDNO: 66的一種輕鏈CDRl區(qū)、 沈QIDN0:67的一種輕鏈CDR2區(qū)W及沈QIDN0:68的一種輕鏈CDR3區(qū)（稱為CR9502)。 CR9501和CR9502包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，W及因此分別具有抗體58巧和30D8的結(jié)合特異 性，先前已經(jīng)展示運(yùn)些抗體與處于其融合前構(gòu)象的RSVF蛋白質(zhì)而非融合后構(gòu)象特異性地 結(jié)合（參見(jiàn)WO2012/006596)。
[0027] 在某些實(shí)施例中，運(yùn)些重組融合前RSVF多膚包含被至少一個(gè)如上所述的融合前 特異性單克隆抗體識(shí)別的至少一個(gè)表位并且是=聚的。
[0028] 在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的融合前RSVF多膚包含位置67上氨基酸殘 基的一種突變和/或位置215上氨基酸殘基的一種突變。
[0029] 在某些實(shí)施例中，位置67上的氨基酸突變成一種疏水性氨基酸。
[0030] 在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的融合前RSVF多膚包含位置67上氨基酸殘 基N或T的一種突變和/或位置215上氨基酸殘基S的一種突變。
[0031] 在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的融合前RSVF多膚包含一種Fl結(jié)構(gòu)域和一 種F2結(jié)構(gòu)域W及將所述Fl結(jié)構(gòu)域連接到所述F2結(jié)構(gòu)域的包含從1到10個(gè)氨基酸殘基的 一種連接序列，其中運(yùn)些多膚進(jìn)一步包含位置67上氨基酸殘基N或T的一種突變和/或位 置215上氨基酸殘基S的一種突變。
[0032] 在某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的融合前RSVF多膚包含一種截短的Fl結(jié)構(gòu) 域和一種F2結(jié)構(gòu)域W及將所述截短的Fl結(jié)構(gòu)域連接到所述F2結(jié)構(gòu)域的包含從1到10個(gè) 氨基酸殘基的一種連接序列，其中運(yùn)些多膚進(jìn)一步包含位置67上氨基酸殘基N或T的一種 突變和/或位置215上氨基酸殘基S的一種突變。
[0033] 如與一種野生型RSVF蛋白質(zhì)中的RSVFl和/或F2結(jié)構(gòu)域相比，本發(fā)明的多膚 因此在Fl和/或F2結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)穩(wěn)定化突變。
[0034] 在某些實(shí)施例中，融合前RSVF多膚包含位置67上氨基酸殘基N或T到I的一種 突變（N/T67I)和/或位置215上氨基酸殘基S到P的一種突變（S215P)。
[0035] 眾所周知RSVW具有兩個(gè)抗原性亞群A和B的一種單一血清型存在。兩個(gè)群組的 成熟加工的F蛋白質(zhì)的氨基酸序列約93%-致。如在本申請(qǐng)中所使用，氨基酸位置參考來(lái) 自A2病毒株的RSVF蛋白質(zhì)的序列（SEQIDNO: 1)給出。如在本發(fā)明中所使用，措辭"RSV F蛋白質(zhì)的位置"X"上的氨基酸因此意指與SEQIDNO: 1的RSVA2病毒株的RSVF蛋白 質(zhì)中位置"X"上的氨基酸相對(duì)應(yīng)的氨基酸。注意，在本申請(qǐng)中所使用的編號(hào)系統(tǒng)中，1是指 一個(gè)未成熟FO蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸（SEQIDNO: 1)。當(dāng)使用一種RSV病毒株而不是A2 病毒株時(shí)，F(xiàn)蛋白質(zhì)的氨基酸位置將通過(guò)在必要時(shí)插入空位使其他RSV病毒株的序列與SEQ IDN0:1的F蛋白質(zhì)比對(duì)，參考SEQIDN0:1的A2病毒株的F蛋白質(zhì)的編號(hào)來(lái)編號(hào)?？蒞 使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法，例如通過(guò)CLUSTALW、Bioedit或CLC工作臺(tái)來(lái)進(jìn)行序列比 對(duì)。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的一種氨基酸可W是二十種天然存在（或'標(biāo)準(zhǔn)'氨基酸）的任一種或 其變體，比如例如D-氨基酸（具有手性中屯、的氨基酸的D-對(duì)映體）或在蛋白質(zhì)中未天然 發(fā)現(xiàn)的任何變體，比如例如正亮氨酸。運(yùn)些標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可W基于其性質(zhì)分成若干群組。重 要因素是電荷、親水性或疏水性、尺寸W及官能團(tuán)。運(yùn)些性質(zhì)對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)-蛋 白質(zhì)相互作用來(lái)說(shuō)是重要的。一些氨基酸具有特殊的性質(zhì)，例如可W與其他半脫氨酸殘基 形成共價(jià)二硫鍵（或二硫橋鍵）的半脫氨酸，誘發(fā)多膚主鏈轉(zhuǎn)角的脯氨酸，W及比其他氨基 酸更靈活的甘氨酸。表11展示運(yùn)些標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的縮寫(xiě)和性質(zhì)。
[0037] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解可W通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行突變。根據(jù) 本發(fā)明的突變優(yōu)選地引起如與不包含該（運(yùn)些）突變的RSVF多膚相比，融合前RSVF多 膚的表達(dá)水平增加和/或穩(wěn)定化增加。
[0038] 在某些實(shí)施例中，運(yùn)些融合前RSVF多膚是可溶性的。
[0039] 在某些實(shí)施例中，運(yùn)些融合前RSVF多膚進(jìn)一步包含一種被連接到所述截短的Fl 結(jié)構(gòu)域的異源=聚結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明，展示通過(guò)將一種異源=聚結(jié)構(gòu)域連接到一種截短 的Fl結(jié)構(gòu)域的C-末端氨基酸殘基，任選地與一種連接Fl和F2結(jié)構(gòu)域的連接序列和該（運(yùn) 些）穩(wěn)定化突變組合，提供了展示高表達(dá)并且結(jié)合于融合前特異性抗體的RSVF多膚，指示 運(yùn)些多膚處于融合前構(gòu)象。另外，運(yùn)些RSVF多膚穩(wěn)定在融合前構(gòu)象，即，即使在加工運(yùn)些 多膚后，它們?nèi)匀唤Y(jié)合于融合前特異性抗體CR9501和/或CR9502,指示該融合前特異性表 位被保留。
[0040] 在其他實(shí)施例中，運(yùn)些融合前RSVF多膚包含一種或多種選自下組的其他突變 (如與野生型RSVF蛋白質(zhì)相比），該組由W下各項(xiàng)組成：
[0041] (a)位置46上氨基酸殘基的一種突變；
[0042] 化）位置77上氨基酸殘基的一種突變；
[0043] (C)位置80上氨基酸殘基的一種突變；
[0044] (d)位置92上氨基酸殘基的一種突變；
[0045] (e)位置175上氨基酸殘基的一種突變；
[0046] (f)位置184上氨基酸殘基的一種突變；
[0047] (g)位置185上氨基酸殘基的一種突變；
[0048] 化）位置201上氨基酸殘基的一種突變；